甘肅

1. 問題的提出

（節(jié)選）如圖1為“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)中樣品稀釋示意圖。據(jù)圖分析正確的是（ ）

圖1

C. 5號(hào)試管的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為1.7×109個(gè)

【解析一】5號(hào)試管進(jìn)行稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為（168+175+167）÷3×105×10=1.7×108個(gè)，C 錯(cuò)誤。

【解析二】5號(hào)試管進(jìn)行稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為（168+175+167）÷3×105×10÷10=1.7×107個(gè)，C錯(cuò)誤。

這是某教輔資料中的一道應(yīng)用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物數(shù)目的習(xí)題，關(guān)于C選項(xiàng)的解析存在兩種不同的看法。對(duì)比分析，上述解析的分歧有兩方面：一是5號(hào)試管的稀釋倍數(shù)到底是多少倍？二是根據(jù)教材公式計(jì)算所得結(jié)果到底是每克土壤樣品中的菌株數(shù)還是10 g樣品中的菌株數(shù)？

2. 從梯度稀釋過程判斷稀釋倍數(shù)

應(yīng)用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)的關(guān)鍵是將樣品進(jìn)行一系列的梯度稀釋，如何進(jìn)行梯度稀釋？

從人教版教材內(nèi)容來看，這種稀釋方法就是10倍稀釋法，概括地講：一般固體樣品取10 g，液體樣品取10 mL，以無菌操作法將其加入到裝有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩5～10 min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20～30 s，即成101倍稀釋液；再用1 mL無菌吸管，吸取101倍稀釋液1 mL移入9 mL無菌水的試管中，吹洗3次，讓菌液混合均勻，即成102倍稀釋液；再換一支無菌吸管吸取102倍稀釋液1 mL移入9 mL無菌水的試管中，即成103倍稀釋液；以此類推，一定要每次更換吸管，連續(xù)稀釋，制成 104、105、106、107、108、109等一系列稀釋度菌液，供平板接種使用。

從上述稀釋過程可以看出：（1）固體樣品的101倍稀釋液是按照質(zhì)量百分比濃度稀釋，其他倍數(shù)稀釋液是按照體積比濃度稀釋，而液體樣品的稀釋都是按體積比濃度稀釋；（2）低稀釋倍數(shù)的稀釋液體積與無菌水的體積相加即為高稀釋倍數(shù)稀釋液總體積；（3）樣品無論是固體樣品還是液體樣品，10 g或10 mL樣品加入90 mL無菌水中，即為將樣品稀釋101倍，將101倍稀釋液的總體積看成100 mL。這樣處理簡單易行，操作方便。

由此可見，如果每次都是稀釋10倍，稀釋n次，則稀釋倍數(shù)為10n；如果第一次稀釋100倍，后續(xù)稀釋都是10倍，共稀釋n次，則稀釋倍數(shù)為10n+1。故上述習(xí)題中，5號(hào)試管的稀釋倍數(shù)為106倍。

3. 結(jié)合梯度稀釋過程推導(dǎo)計(jì)算公式

結(jié)合上述習(xí)題中的稀釋過程，分別取5號(hào)試管中的稀釋液（即106倍稀釋液）0.1 mL涂布三個(gè)平板，計(jì)數(shù)平均值為C，則10 mL的106倍稀釋液中共有活菌數(shù)為（C÷0.1）×10。這些活菌來自1 mL的105倍稀釋液（4號(hào)試管），則10 mL的105倍稀釋液中共有活菌數(shù)為（C÷0.1）×102。依此類推，100 mL的101倍稀釋液中共有活菌數(shù)為（C÷0.1）×107。10 g土壤樣品全在100 mL的101倍稀釋液中，所以每克土壤樣品中的活菌數(shù)為（C÷0.1）×107÷10=（C÷0.1）×106。該算式中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，0.1為涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（mL）（用V表示），106為稀釋倍數(shù)（用M表示），即可得到稀釋涂布平板法計(jì)算公式：（C÷V）×M。

由此可見，該公式計(jì)算結(jié)果為每克（或每毫升）樣品中的菌株數(shù)。

上述習(xí)題106倍稀釋液下平板上生長的平均菌落數(shù)C=（168+175+167）÷3=170，V=0.1，M=106，所以5號(hào)試管的結(jié)果表明每克土壤中的菌株數(shù)為1.7×109個(gè)，即解析一、二均存在理解誤區(qū)。

4. 典型例題

【例1】（2018年，全國卷Ⅰ，第37題節(jié)選）（4）甲、乙兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定某一土壤樣品中微生物的數(shù)量，在同一稀釋倍數(shù)下得到以下結(jié)果：

甲同學(xué)涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是110、140和149，取平均值133；

乙同學(xué)涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是27、169和176，取平均值124。

有人認(rèn)為這兩位同學(xué)的結(jié)果中，乙同學(xué)的結(jié)果可信度低，其原因是：________________。

【解析】計(jì)數(shù)時(shí)一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。乙同學(xué)一個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差懸殊，可信度低。

【答案】乙同學(xué)的結(jié)果中，1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差懸殊，結(jié)果的重復(fù)性差

【例2】（2016年，四川卷，第10題節(jié)選）圖甲是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過程，圖乙是脲酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA部分序列（圖乙略）。

（2）在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。

該過程采取的接種方法是________，每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為________×108個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測得的細(xì)菌數(shù)較________。

【解析】（2）平板上接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品液，該接種方法為稀釋涂布平板法；5個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191，選擇菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，0.1 mL稀釋倍數(shù)為105的培養(yǎng)液含有產(chǎn)脲酶菌的數(shù)目為（156+178+191）÷3=175個(gè)，則每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為（175÷0.1）×105=1.75×108個(gè)；可能2個(gè)或多個(gè)產(chǎn)脲酶菌共同形成一個(gè)菌落，與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法相比，此計(jì)數(shù)方法測得的細(xì)菌數(shù)較少。

【答案】（2）稀釋涂布平板法 1.75 少

【例3】（2014年，全國卷Ⅱ，第39題節(jié)選）為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細(xì)菌含量，并進(jìn)行了細(xì)菌分離等工作?；卮鹣铝袉栴}：

（1）該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中的細(xì)菌含量。在涂布接種前，隨機(jī)選取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時(shí)間，這樣做的目的是______；然后，將1 mL水樣稀釋100倍，在3個(gè)平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為______。

【解析】（1）為了確定培養(yǎng)基的滅菌是否合格，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一般會(huì)隨機(jī)選取若干滅菌后的空白平板培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落出現(xiàn)；根據(jù)題意，C=38，V=0.1，M=100，據(jù)此計(jì)算出每毫升水樣中的活菌數(shù)是3.8×104，再乘以103即可得出每升水樣中的活菌數(shù)是3.8×107。

【答案】（1）檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格3.8×107

5. 結(jié)語

在教學(xué)過程中，教師應(yīng)結(jié)合人教版教材選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》第23頁：圖2-7樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖引導(dǎo)學(xué)生對(duì)稀釋和取樣培養(yǎng)過程進(jìn)行分析，學(xué)會(huì)判斷稀釋倍數(shù)，自主總結(jié)出稀釋涂布平板法計(jì)算公式。否則，直接將公式告知學(xué)生，會(huì)使學(xué)生不明所以，導(dǎo)致應(yīng)用公式錯(cuò)誤頻出的情況。例2題目中的“每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為________×108個(gè)”就是對(duì)本文提到的兩種解析的最好回應(yīng)。當(dāng)出現(xiàn)這種說法不一的情況時(shí)，教師要敢于引導(dǎo)學(xué)生質(zhì)疑，培養(yǎng)學(xué)生的批判性思維。

另外，從近幾年高考題對(duì)稀釋涂布平板法的考查情況來看，涉及對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析、計(jì)數(shù)等，如上述例1和例3，其實(shí)這些設(shè)問方向都是圍繞“使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值”這一核心問題展開的。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和解答題目時(shí)應(yīng)該注意：（1）嚴(yán)格按無菌操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（2）隨機(jī)選取若干滅菌后的平板先培養(yǎng)一段時(shí)間，檢測平板滅菌是否徹底，如果出現(xiàn)菌落，說明滅菌不徹底，需要重新倒平板；或在空白平板上涂布等量的無菌水作為空白對(duì)照，以確定培養(yǎng)過程中是否存在雜菌污染現(xiàn)象。如果空白對(duì)照組的平板上出現(xiàn)菌落，說明存在雜菌污染現(xiàn)象，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（3）每個(gè)稀釋倍數(shù)的菌液至少涂布3個(gè)平板，設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值，以減小誤差，提高可信度；（4）注意接種量（V）和培養(yǎng)時(shí)間，一般接種0.1 mL稀釋液，接種量過多或時(shí)間過長會(huì)造成兩個(gè)菌落連成一個(gè)；（5）選擇菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算時(shí)應(yīng)該去掉偏離這個(gè)范圍的數(shù)據(jù)。