羅 艷，李裕冬，姚 民，羅曉波,3*，王瓊瑤

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院，四川 成都 610024;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3.峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站，四川 峨眉山 614201)

礦物開采、煤和原油的燃燒以及農(nóng)業(yè)施肥等是土壤重金屬鎘(Cd)的主要來(lái)源[1-3]。鎘會(huì)引起水環(huán)境惡化，土壤肥力退化和農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)下降，也能通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，直接影響和危及人類的健康[4]。當(dāng)鎘以Cd2+及其絡(luò)合物形式存在時(shí)，極易被植物吸收并積累[5]。利用生長(zhǎng)迅速、生物量大、根系發(fā)達(dá)的木本植物來(lái)進(jìn)行鎘污染土壤修復(fù)，具有價(jià)格低廉、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是鎘污染土壤修復(fù)的研究熱點(diǎn)之一[4-10]。

Cd是四川省土壤重金屬污染的主要特征污染物，尤以攀西地區(qū)、成都平原區(qū)和川南地區(qū)等部分區(qū)域污染為重。研究發(fā)現(xiàn)，4種鄉(xiāng)土木本植物(云南松Pinusyunnanensis、榿木Alnuscremastogyne、紅椿Toonaciliata、五小葉槭Acerpentaphyllum)的種子及其幼苗生長(zhǎng)初期均表現(xiàn)出較高的低濃度Cd耐受性[11]，但它們對(duì)Cd脅迫的生理生化響應(yīng)機(jī)制仍未明確?；钚匝?ROS)是植物代謝過(guò)程中的毒副產(chǎn)品，在穩(wěn)定條件下，可以通過(guò)各種抗氧化防御機(jī)制清除[12]。在逆境脅迫下，ROS的過(guò)多積累會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生傷害[13]，而植物體內(nèi)存在的抗氧化機(jī)制可以在一定程度上減緩這種傷害。植物體內(nèi)具有清除ROS的抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶和抗氧化劑系統(tǒng)。抗氧化酶主要包含超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等[14]，而抗氧化劑以谷胱甘肽為代表[15]。因此，本研究分析了4種鄉(xiāng)土木本植物幼苗葉片生長(zhǎng)初期抗氧化系統(tǒng)對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)，并分析了Cd脅迫下其膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)和葉綠素(CHL)含量的變化，以期從生理生態(tài)學(xué)角度進(jìn)一步探討Cd脅迫下這4種鄉(xiāng)土木本植物的應(yīng)對(duì)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究實(shí)驗(yàn)于2017年10—11月在成都進(jìn)行，4種林木的幼苗由其種子萌發(fā)而來(lái)[11]，培養(yǎng)于裝有滅菌蛭石的大小規(guī)格一致的培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)時(shí)間為2個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

4種林木的幼苗在光照培養(yǎng)箱(光周期12 h/12 h，20℃/18℃(光/暗比)，濕度80%)培養(yǎng)。每周1次給幼苗加入5 mg·L-1(標(biāo)記為5Cd，下同)、25 mg·L-1(標(biāo)記為25Cd，下同)、50 mg·L-1(標(biāo)記為50Cd，下同)、75 mg·L-1(標(biāo)記為75Cd，下同)、100 mg·L-1(標(biāo)記為100Cd，下同)的氯化鎘溶液，該溶液用分析純CdCl·22.5H2O配制，以等量蒸餾水培養(yǎng)作對(duì)照(標(biāo)記為CK，下同)。

隨機(jī)采取新鮮葉片0.5 g放入研缽，加入2 mL 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸緩沖液冰浴研磨，勻漿倒入 10 mL 離心管中，再加3 mL于研缽中沖洗研缽后倒入離心管，10 000 r·min-1冷凍離心20 min，上清液倒入試管中置于0～4℃下保存待用。然后，將幼苗植株與土壤分離，去離子水洗凈晾干，用直尺測(cè)量幼苗地上和地下部分長(zhǎng)度。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

SOD活性采用氮藍(lán)四唑法[16]； CAT活性采用紫外分光光度法[17]； POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[18]； MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)加熱比色法[18]；還原型谷胱甘肽(GSH)用分光光度計(jì)法[16]；葉綠素(CHL)含量采用分光光度計(jì)法[18]s。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及方差分析

采用 Microsoft Office Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表分析，并采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用真實(shí)顯著性差異(Tukey’s HSD，方差具有齊次性時(shí))和塔姆黑尼檢驗(yàn)(Tamhane’s T2， 方差不齊時(shí))進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd對(duì)幼苗形態(tài)的影響

由表1可知，隨著Cd濃度的升高，不同物種具有不同的表現(xiàn)：(1)五小葉槭的地上長(zhǎng)度略增，在100Cd時(shí)其平均值為對(duì)照組的117.6%(P>0.05)；地下長(zhǎng)度在25Cd時(shí)則顯著降低(P<0.05)，在100Cd時(shí)其平均值僅為對(duì)照組的31.0%(P<0.05)。(2)紅椿的地上長(zhǎng)度顯著下降，在100Cd時(shí)其平均值為對(duì)照組的77.8%(P<0.05)；地下長(zhǎng)度無(wú)明顯變化。(3)榿木的地上長(zhǎng)度略有增加，在100Cd時(shí)其平均值為對(duì)照組的111.5%(P>0.05)；地下長(zhǎng)度顯著減少，在100Cd時(shí)其平均值為對(duì)照組的41.4%(P<0.05)。(4)云南松的地上和地下部分在不同濃度的鎘脅迫下有所波動(dòng)，但總體影響不大。

表1 不同濃度鎘脅迫對(duì)4種林木幼苗形態(tài)的影響

2.2 Cd對(duì)幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

隨著Cd濃度的升高，4種林木幼苗葉片的CAT活性、SOD活性、POD活性以及GSH活性均有所增加(見圖1)，具體表現(xiàn)為：(1)SOD活性方面，五小葉槭、紅椿和榿木均隨Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組分別高56.8%、253.2%和93.3%；云南松在5Cd時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，此后隨Cd濃度的增加而顯著增高，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組高66.0%。(2)CAT活性方面，五小葉槭和紅椿隨Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組分別高41.9%和35.1%；榿木僅100Cd時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，較對(duì)照組高36.1%；云南松在5Cd時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，此后隨Cd濃度的增加而顯著增加，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組高93.6%。(3)POD活性方面，五小葉槭、紅椿和榿木均隨Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組分別高67.7%、88.1%和191.4%；云南松在5Cd時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，此后隨Cd濃度的增加而顯著增加，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組高40.9%。(4)GSH方面，隨著Cd濃度的增加，五小葉槭和云南松總體呈減少趨勢(shì)(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組分別減少31.3%和44.3%；紅椿和榿木略有減少(P>0.05)，與對(duì)照組相比，減少幅度分別為22.2%和20.9%。

2.3 Cd對(duì)幼苗葉片MDA含量的影響

隨著Cd濃度的增加，4種林木葉片的MDA含量均有所增加(見圖2)，但具體表現(xiàn)有所不同：(1)五小葉槭的MDA含量在5Cd時(shí)略增(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值比對(duì)照組高11.6%。(2)紅椿的MDA含量在低于50Cd時(shí)較對(duì)照組略增(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)比對(duì)照組高17.8%。(3)榿木的MDA含量在低于75Cd時(shí)較對(duì)照組略增(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)比對(duì)照組高10.1%。(4)云南松的MDA含量在低于25Cd時(shí)較對(duì)照組略增(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加顯著增加(P<0.05)，100Cd時(shí)比對(duì)照組高35.0%。

2.4 Cd對(duì)幼苗葉片CHL含量的影響

隨著Cd濃度的增加，4種林木葉片的葉綠素含量均有所下降(見圖3)，但具體表現(xiàn)有所不同：(1)五小葉槭的葉綠素含量顯著下降(P<0.05)，100Cd時(shí)其平均值僅為對(duì)照組的51.0%。(2)紅椿在低于75Cd時(shí)其葉綠素含量均較對(duì)照組略降(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，100Cd時(shí)葉綠素含量為對(duì)照組的74.0%；(3)榿木在低于50Cd時(shí)其葉綠素含量均較對(duì)照組略降(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，100Cd時(shí)葉綠素含量為對(duì)照組的57.8%；(4)云南松在低于100Cd時(shí)，其葉綠素含量均較對(duì)照組略降(P>0.05)，此后隨著Cd濃度的增加葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，100Cd時(shí)葉綠素含量為對(duì)照組的74.3%。

圖1 不同濃度鎘脅迫下4種林木幼苗的抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)(N=3)

圖2 不同濃度鎘脅迫下4種林木幼苗葉片的MDA量(N=3)

圖3 不同濃度鎘脅迫下4種林木幼苗葉片的CHL含量(N=3)

3 討論與結(jié)論

為了適應(yīng)鎘脅迫的環(huán)境，保證體內(nèi)產(chǎn)生與清除活性氧自由基的物質(zhì)平衡，本研究中4種鄉(xiāng)土樹木(五小葉槭、紅椿、榿木和云南松)幼苗植物從外部形態(tài)到內(nèi)部的生理生化過(guò)程均發(fā)生了變化。

外部形態(tài)上，鎘脅迫下五小葉槭和榿木均表現(xiàn)出地下部分受毒害，長(zhǎng)度顯著下降的現(xiàn)象。為了彌補(bǔ)地下部分的損失，這兩種植物的地上部分可能存在代償性的增長(zhǎng)。紅椿的表現(xiàn)與之相反，推測(cè)可能有大量的鎘進(jìn)入紅椿的地上部分并對(duì)其造成一定的毒害。云南松表現(xiàn)出良好的耐受性，地上和地下的長(zhǎng)度均未出現(xiàn)顯著變化。

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，是反映膜傷害和細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的重要指標(biāo)[25,26]。本研究結(jié)果顯示，低濃度的Cd脅迫下這4種幼苗適應(yīng)良好，MDA含量未發(fā)生顯著變化；較高濃度Cd脅迫下，云南松受到的影響最大，其它3種幼苗受到的影響較小。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，其含量變化與光合作用密切相關(guān)[27,28]。Cd2+一方面可能通過(guò)與葉綠體中蛋白質(zhì)的巰基(-SH-)結(jié)合，破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致葉綠素的降解[29]；另一方面，Cd2+還可以通過(guò)抑制卡爾文循環(huán)相關(guān)的酶活性和使氣孔部分關(guān)閉等途徑，直接或間接影響植物的光合作用[30]。本研究結(jié)果表明，五小葉槭的葉綠素對(duì)Cd脅迫最為敏感，其次是榿木，而紅椿和云南松葉片的葉綠素含量在低濃度的Cd脅迫下無(wú)顯著變化。

總體上，在鎘脅迫環(huán)境下這4種林木幼苗在生理生態(tài)方面發(fā)生了明顯變化，并表現(xiàn)出較好的低濃度耐受性；在高濃度Cd脅迫下，紅椿和云南松的耐受能力可能更好。