劉連，王義，史植元，張美萍，孫春玉

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植物干細(xì)胞培養(yǎng)研究進展

劉連，王義，史植元，張美萍，孫春玉

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 人參基因資源開發(fā)與利用工程研究中心，吉林 長春 130118

劉連, 王義, 史植元, 等. 植物干細(xì)胞培養(yǎng)研究進展. 生物工程學(xué)報, 2018, 34(11): 1734–1741.Liu L, Wang Y, Shi ZY, et al. Advances in plant stem cell culture. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1734–1741.

植物干細(xì)胞位于分生組織，是處于未分化狀態(tài)的細(xì)胞，液泡化程度低，具有較高的線粒體活性，遺傳穩(wěn)定，具有很強的自我更新和再生能力。植物干細(xì)胞培養(yǎng)在下游制藥和功能性食品以及化妝品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用潛質(zhì)。文中綜述了植物干細(xì)胞的基本培養(yǎng)技術(shù)、鑒別技術(shù)，為該領(lǐng)域的深入研究提供參考。

植物，干細(xì)胞，分生組織，莖尖，根尖，培養(yǎng)

隨著我國制藥工業(yè)及功能性食品行業(yè)的迅速發(fā)展，對植物中活性成分的需求日益增長。植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保護心腦血管等的作用[1]，但其質(zhì)量受環(huán)境因素和收獲條件的影響，活性物質(zhì)產(chǎn)量低[2-3]，有些植物的活性成分僅限于特定的組織部位或生長階段合成[4-5]。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、人工合成困難的活性成分，傳統(tǒng)的愈傷組織培養(yǎng)方式雖然可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品[6]，節(jié)約了資源，但是經(jīng)歷脫分化的愈傷組織液泡化程度高，常常增加了細(xì)胞的異質(zhì)性，對振蕩培養(yǎng)的剪切力敏感，經(jīng)多次有絲分裂后，容易產(chǎn)生DNA甲基化[7]以及轉(zhuǎn)座子被激活[8]等變異現(xiàn)象，導(dǎo)致培養(yǎng)過程不穩(wěn)定，天然產(chǎn)物的產(chǎn)量、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點，難以適應(yīng)現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)需求[9]。

干細(xì)胞的概念起源于20世紀(jì)60年代的動物胚胎學(xué)研究，其含義“具有自我更新復(fù)制能力和分化潛能的細(xì)胞”。與此相對應(yīng)，植物干細(xì)胞實為傳統(tǒng)植物解剖學(xué)范疇中的分生組織，包括莖尖分生組織(Shoot apical meristem)、根尖分生組織(Root apical meristem)、側(cè)生分生組織[10]以及部分髓射線細(xì)胞，其具有產(chǎn)生所有分化細(xì)胞類型的能力[11]以及旺盛的分裂能力和較高的遺傳穩(wěn)定性。植物干細(xì)胞具有多個小液泡、線粒體活性高、聚集度低[12-13]、細(xì)胞壁無木質(zhì)素沉積[14-15]等特點，低溫保藏后仍維持較高的細(xì)胞活性，在懸浮培養(yǎng)過程中大部分以單細(xì)胞形式存在，對剪切力不敏感，能維持穩(wěn)定的增殖速度，可以長期穩(wěn)定培養(yǎng)。2010年，Lee等在上成功報道了紅豆杉形成層干細(xì)胞的分離及3 t生物反應(yīng)器培養(yǎng)研究[16]，隨后越來越多種植物的干細(xì)胞研究被報道，本研究在總結(jié)上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對當(dāng)前植物干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒別及應(yīng)用情況進行綜述，并對植物干細(xì)胞培養(yǎng)的前景進行了展望，為該領(lǐng)域的深入研究提供參考。

1 植物干細(xì)胞培養(yǎng)

植物干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，其分離方法是建立在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上，具體步驟包括：1) 含分生組織的外植體消毒處理；2) 干細(xì)胞的誘導(dǎo)；3) 分離并收集干細(xì)胞；4) 干細(xì)胞的鑒定。目前關(guān)于植物干細(xì)胞的誘導(dǎo)和大規(guī)模培養(yǎng)等研究報道較少，植物干細(xì)胞培養(yǎng)僅見于形成層干細(xì)胞、莖尖干細(xì)胞及根尖干細(xì)胞培養(yǎng)。

1.1 植物貯藏根形成層干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

目前關(guān)于貯藏根形成層的培養(yǎng)，僅見于胡蘿卜、人參及當(dāng)歸。具體包括：外植體的消毒、抗褐化培養(yǎng)、滲透處理以及誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得形成層干細(xì)胞系。在實際培養(yǎng)過程中滲透處理對形成層干細(xì)胞系的獲得尤為重要，所選用的滲透劑以及滲透劑的濃度至關(guān)重要，實際操作過程中0.6 mol/L蔗糖效果最佳，使對滲透壓敏感的非形成層組織壞死，而對滲透壓不敏感的干細(xì)胞保持活性。處理后的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一段時間后，所得細(xì)胞系即為干細(xì)胞系[17]。滲透劑一般為蔗糖溶液，也有用KCl、甘露醇等作為滲透劑的報 道[18-19]。干細(xì)胞誘導(dǎo)之初對植物激素的要求相對嚴(yán)格，有報道表明誘導(dǎo)初期用IBA或IAA，而其他激素?zé)o效果，繼代培養(yǎng)基中一般添加2,4-D即可?；谏鲜龇椒?，人參、胡蘿卜以及當(dāng)歸細(xì)胞系均已成功培養(yǎng)[17,20]，并且建立了當(dāng)歸和人參細(xì)胞的氣升式反應(yīng)器，人參形成層細(xì)胞與愈傷組織相比，倍增時間為3?6 d，而愈傷組織的倍增時間為28 d，生長速度提高了5?9倍，人參皂苷的含量(Re、Rb1、Rb2和Rd)尤其是在野山參中達到了3%。該細(xì)胞系提取物可以抗腫瘤、提高免疫力，并且還具有抗氧化、抑制皺紋產(chǎn)生的效果[17]。當(dāng)歸干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)21 d后，鮮重增長為2.83倍，愈傷組織為1.67倍，同時當(dāng)歸干細(xì)胞合成次級代謝產(chǎn)物活性較強，干細(xì)胞阿魏酸含量為9.118 mg/kg，而在愈傷組織中未檢測到阿魏酸[20]。

筆者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)進行人參形成層干細(xì)胞的分離時有的材料自帶內(nèi)生菌，會對實驗過程造成干擾，需要在實際的分離過程中選擇合適的消毒方法以及培養(yǎng)條件，一般選擇在干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入抗生素處理；另外，可能由于品種不同，形成層干細(xì)胞誘導(dǎo)的條件不同，實驗過程中需要針對特定的品種摸索具體的實驗條件，才能保證成功獲得干細(xì)胞系。

1.2 木本及草本植物形成層干細(xì)胞的培養(yǎng)

采集的枝條置于抗壞血酸溶液中防止氧化，外植體常規(guī)消毒后，盡量去除韌皮部等非形成層組織，將含有形成層的組織切分后置于含有IAA或NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一段時間后形成層細(xì)胞自然分層，收集細(xì)胞繼代培養(yǎng)。研究者們利用上述方法成功獲得了銀杏及紅豆杉干細(xì)胞系[21-22]，所獲得的干細(xì)胞系建立了大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)體系，銀杏干細(xì)胞最終建立了250 L的氣升式反應(yīng)器，且干細(xì)胞干重達到了11.7 g/L，其提取物可以清除自由基，具有強烈的抗氧化作用，在制藥、功能性食品領(lǐng)域具有較強的工業(yè)實用性。在紅豆杉干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面，氣升式反應(yīng)器中干細(xì)胞增長明顯優(yōu)于愈傷組織，3 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4個月后，來自針葉和胚胎的愈傷組織(Callus) 干重分別為3.33 g和5.08 g，而干細(xì)胞(Stem cell) 干重為3 819.44 g。并且3 L反應(yīng)器中，加入誘導(dǎo)子50 mg/L殼聚糖和100 μmol/L茉莉酮酸甲酯，以及0.1 mmol/L的前體苯丙氨酸處理后的愈傷組織紫杉醇含量分別達到了11 mg/kg和13 mg/kg，而干細(xì)胞中紫杉醇含量達到了98 mg/kg，明顯高于愈傷組織中紫杉醇含量，經(jīng)過研究人員對培養(yǎng)參數(shù)的篩選和優(yōu)化，建立了3 t紅豆杉干細(xì)胞生物反應(yīng)器，實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[16]。

除此之外草本植物干細(xì)胞也有相關(guān)報道，韓國建國大學(xué)Moon等基于上述方法建立了長春花干細(xì)胞 系[23]，結(jié)果表明，含有1.5 mg/L NAA和0.5 mg/L KT的B5培養(yǎng)基中長春堿含量達到最大值(0.794 mg/g)，含有1.5 mg/L NAA和1.5 mg/L KT的 B5培養(yǎng)基中長春新堿的含量達到最大值(0.279 mg/g)。不僅如此，韓國云火公司的Lee和Jin等已經(jīng)成功獲得了番茄和菊花以及艾蒿干細(xì)胞，并建立了氣升式生物反應(yīng)器，3 L反應(yīng)器中，番茄干細(xì)胞的生長速率達到了6.3倍，而愈傷組織的生長速率只有1.9倍，在250 L的氣升式反應(yīng)器中干細(xì)胞的干重達到了12.6 g/L，番茄干細(xì)胞的提取物可以促進原膠原的形成，抑制膠原分解酶的形成，起到了抑制皺紋的作用[24]。菊花干細(xì)胞在3 L反應(yīng)器中培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞由最初的4.1 g/L增長到了11.8 g/L，干細(xì)胞系提取物不僅具有抑制由脂多糖處理引起 的NO產(chǎn)生的效果，而且還具有抑制環(huán)氧化酶-2 (Cyclooxygenase-2，COX-2) 表達的效果，因此該細(xì)胞系可用于生產(chǎn)消炎藥及功能性飲料[25]。

1.3 莖尖干細(xì)胞培養(yǎng)

關(guān)于莖尖干細(xì)胞的分離培養(yǎng)僅見于擬南芥莖尖干細(xì)胞和蘆薈莖尖干細(xì)胞。不同于其他草本植物，蘆薈干細(xì)胞挑選幼嫩的莖尖作為外植體。常規(guī)消毒后，切取莖尖，置于含有NAA和6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。獲得的細(xì)胞團用0.25%的纖維素酶和0.25%的果膠酶進行酶解，所得到的 細(xì)胞即為干細(xì)胞[26]，該細(xì)胞系凍干粉中蘆薈苷 含量達到了150.80 mg/g，顯著增加了蘆薈苷的 含量。

干細(xì)胞系的獲得，除了常規(guī)誘導(dǎo)方面，也有通過轉(zhuǎn)入抗性篩選基因進行干細(xì)胞系建立的報道，廈門大學(xué)沈宏通過該方法建立了擬南芥莖尖干細(xì)胞系[27]。

1.4 根尖干細(xì)胞培養(yǎng)

根尖干細(xì)胞的誘導(dǎo)：首先將去除根冠的根組織切分成1 mm大小，置于含有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一段時間后，靜止中心細(xì)胞繼代于含有2,4-D 的培養(yǎng)基上擴增，利用該方法獲得了水稻干細(xì)胞[28]。在此基礎(chǔ)上暨南大學(xué)的王一飛等建立了鐵皮石斛的干細(xì)胞系，并建立了10 L的懸浮培養(yǎng)體系，利用超低溫冷凍、超聲波破碎以及真空干燥等方法制備了鐵皮石斛干細(xì)胞凍干粉，鐵皮石斛干細(xì)胞提取物具有較高的POD (Peroxidase)、SOD (Superoxide dismutase) 以及CAT (Catalase) 酶活性，具有較強的抗氧化作用，干細(xì)胞凍干粉對成纖維細(xì)胞的光老化具有抑制作用，提高了其SOD酶活性，其制備的眼霜還具去除眼袋和淡化黑眼圈的效果[29]。

2 植物干細(xì)胞的鑒別

植物干細(xì)胞具有多個小液泡、線粒體活性 高[12-13]以及細(xì)胞壁不含木質(zhì)素[14-15,23]等特點，在干細(xì)胞鑒別方面，主要依據(jù)其自身特點對一些特定的細(xì)胞器進行染色觀察，以此區(qū)別于愈傷組織等非干細(xì)胞系。目前常用的染色方法有如下幾種：1) 中性紅液泡系染色；2) 間苯三酚木質(zhì)素染色；3) Janus green B線粒體染色。除此之外，與愈傷組織相比，在干細(xì)胞中存在特異表達或高表達的基因。

2.1 中性紅染色

中性紅是液泡特殊的活體染色劑，由于液泡呈酸性，進入液泡的中性紅解離出大量陽離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色，所以通過液泡染色可以區(qū)別干細(xì)胞系。

韓國云火公司Lee等誘導(dǎo)培養(yǎng)紅豆杉形成層細(xì)胞后，對干細(xì)胞進行了中性紅染色，結(jié)果表明，形成層細(xì)胞內(nèi)具有多個被染色的紅色小液泡，而愈傷組織細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出一個中央大液泡[16]，在人參以及菊花干細(xì)胞中也觀察到具有多個小液泡的現(xiàn)象。實際操作中發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞組織學(xué)染色過程中，中性紅染色使用PBS (Phosphate-buffered saline)比Ringer溶液(Ringer’s solution)染色效果好。

2.2 間苯三酚染色

間苯三酚反應(yīng)是確定木質(zhì)化細(xì)胞壁最常用的方法，間苯三酚在酸性環(huán)境下與細(xì)胞壁中的木質(zhì)素發(fā)生櫻桃紅色或紫紅色反應(yīng)。

Moon等將誘導(dǎo)出來的長春花形成層細(xì)胞與愈傷組織細(xì)胞進行間苯三酚染色，結(jié)果表明，形成層細(xì)胞無鹽酸-間苯三酚染色反應(yīng)，而愈傷組織細(xì)胞發(fā)生紫紅色染色反應(yīng)。這一結(jié)果表明，愈傷組織細(xì)胞的細(xì)胞壁有木質(zhì)素沉積，形成層細(xì)胞無木質(zhì)素沉積為初生壁[23]。筆者在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)間苯三酚染色過程中，鹽酸的濃度對染色效果影響很大，研究發(fā)現(xiàn)低濃度鹽酸顯色效果欠佳，0.5 mol/L以上鹽酸濃度顯色效果較好。

2.3 線粒體染色

Janus green B對線粒體專一性染色，由于線粒體中的細(xì)胞色素氧化酶的作用，使Janus green B始終保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原成無色。干細(xì)胞具有較高的線粒體活性，所以經(jīng)Janus green B染色可以區(qū)別干細(xì)胞系。研究者利用Janus green B對銀杏和番茄形成層細(xì)胞線粒體進行染色，銀杏細(xì)胞線粒體染色結(jié)果顯示出愈傷組織線粒體較少，而形成層細(xì)胞短棒狀線粒體較多，可以為細(xì)胞的增殖和分化提供能量[21,24]。筆者在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，針對線粒體的染色常規(guī)的操作是將材料完全浸沒在染液當(dāng)中，而對于干細(xì)胞系來說，這樣的處理結(jié)果并不理想，進行少量多次滴加染液效果更好。

3 植物干細(xì)胞中特異表達基因的研究

在植物干細(xì)胞中，存在一些特異表達或高表達的基因。() 被認(rèn)為是原形成層細(xì)胞的分子標(biāo)記，在形成層細(xì)胞特異表達，可以保護原形成層前體細(xì)胞不受極性生長素流(AUXIN flow) 的干擾而保持形成層細(xì)胞的穩(wěn)定性[30-31]。(WUSCHEL HOMEOBOX RELATED 4) 基因主要在形成層中表達，形成層中存在TDIF (Tracheary element differentiation inhibitory factor) 多肽，具有抑制形成層細(xì)胞分化并且促進細(xì)胞增殖的功能，與受體激酶PXY (Phloem intercalated with xylem) 胞外結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合形成TDIF-PXY通路促進的表達[32]，并且在形成層分生組織中還存在() 以及() 等上調(diào)表達基因[32-34]。最近研究表明，維管形成層分生組織中() 基因參與維持側(cè)生原基發(fā)育中的正常細(xì)胞分裂模式，是形成層細(xì)胞所必需的[35]。

() 作為莖尖干細(xì)胞分子標(biāo)志基因，在分生組織細(xì)胞表達，可促進分生組織細(xì)胞增殖，WUS蛋白通過胞間連絲運輸?shù)礁杉?xì)胞區(qū)域[36]，直接與啟動子結(jié)合，抑制的表達，從而抑制干細(xì)胞的增殖，二者構(gòu)成CLV-WUS負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路[37]，以維持干細(xì)胞的數(shù)量穩(wěn)定。最新研究發(fā)現(xiàn)CIKs (CLAVATA 3 INSENSITIVE RECEPTOR KINASES)受體激酶作為受體通過磷酸化傳遞的信號，抑制的表達，從而維持莖尖分生組織的平衡[38]。

() 特異性地在根尖靜止中心細(xì)胞中表達，抑制干細(xì)胞的分化，在根尖中CLE40 (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION40) 蛋白在干細(xì)胞和中柱細(xì)胞中表達，通過ACR4(ARABIDOPSIS CRINKLY 4) 受體傳導(dǎo)CLE40 的信號，抑制WOX5的表達，促進干細(xì)胞的分化，以維持根尖干細(xì)胞的穩(wěn)定[39-41]。在根尖干細(xì)胞中還存在(Quiescent center) 以及[42-43]等特異表達的基因，近年研究表明在根尖干細(xì)胞中存在RGF (Root meristem growth factor)小肽[44]，RGF的受體RGFRs (RGF receptors)和RGI (RGF1 INSENSITIVES) 能夠響應(yīng)RGF信號，促進() 轉(zhuǎn)錄因子的表達，可促進分生組織細(xì)胞的分裂，以維持根尖分生組織穩(wěn)定[45-47]。

早在2003年研究者開始對根尖干細(xì)胞的表達譜進行了分析，結(jié)果表明在根尖干細(xì)胞區(qū)域存在差異表達基因[48]，韓國的Lee等通過基因表達譜比較了紅豆杉形成層細(xì)胞和愈傷組織細(xì)胞的差異，確定了563個基因在形成層細(xì)胞中表達不同，其中296個基因呈現(xiàn)正調(diào)控[16]。Yadav等對莖尖干細(xì)胞的表達譜也進行了分析，結(jié)果表明莖尖干細(xì)胞中，在表達區(qū)域還存在、() 等特異表達的基因，但這些基因的功能有待進一步研究[49-50]。

4 植物干細(xì)胞應(yīng)用及展望

植物干細(xì)胞培養(yǎng)克服了傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中培養(yǎng)物對剪切力敏感、次生代謝產(chǎn)物低、遺傳不穩(wěn)定等問題。與愈傷組織相比，植物干細(xì)胞在長期培養(yǎng)條件下可以維持穩(wěn)定的增殖速度，在食品、藥品及化妝品行業(yè)具有更廣闊的應(yīng)用前景。研究表明經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)后提取的有效成分在治療艾滋病、抑制黑色素瘤、治療肝炎、抗氧化和抗衰老、抑制異常的細(xì)胞凋亡、殺傷癌細(xì)胞等方面都具有很好的療效[22-23,51-56]。

韓國在植物干細(xì)胞誘導(dǎo)及培養(yǎng)方面積累了豐富的經(jīng)驗，已報道了人參及野山參、長春花、紅豆杉、銀杏、菊花等藥用植物形成層干細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)、鑒定、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)、培養(yǎng)物活性成分分析等[16-17,21,23,25]。我國的科學(xué)家們在該領(lǐng)域的研究也取得了豐碩的成果：嚴(yán)春燕等分離并培養(yǎng)了當(dāng)歸干細(xì)胞[20]；廈門大學(xué)沈宏等分離培養(yǎng)了擬南芥莖尖干細(xì)胞[27]；暨南大學(xué)王一飛等用鐵皮石斛干細(xì)胞凍干粉生產(chǎn)的眼霜具有明顯的抗衰老效果[29]；曾憲卓等通過分離并培養(yǎng)蘆薈莖間干細(xì)胞，測得蘆薈干細(xì)胞凍干粉中蘆薈苷的含量顯著提高，達到了150.80 mg/g，為醫(yī)療、化妝品和功能性食品行業(yè)提供了良好的基礎(chǔ)[26]；功能性食品方面，陳海佳等制備的蘋果干細(xì)胞凍干粉可以作為胃腸道保健食品[57]；林淑芳等利用番茄干細(xì)胞凍干粉制備了口服液、飲料和白酒，研究結(jié)果表明，其制備的產(chǎn)品具有抗氧化、預(yù)防癌癥、降血壓、降低膽固醇以及調(diào)節(jié)免疫力的效果[58]。

植物細(xì)胞不受動物病原體的污染，生產(chǎn)成本較低，并且植物干細(xì)胞培養(yǎng)具有諸多優(yōu)勢，利用基因工程手段，以植物干細(xì)胞作為受體生產(chǎn)抗體、疫苗以及其他蛋白藥物也將會在生物藥物生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。在實際培養(yǎng)中關(guān)于植物干細(xì)胞分離和鑒別方面還存在很多不足，外植體誘導(dǎo)出細(xì)胞后，如何精確分離干細(xì)胞，保證干細(xì)胞的純度，以及建立規(guī)范的鑒定體系是目前干細(xì)胞培養(yǎng)面臨的主要問題。

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Advances in plant stem cell culture

Lian Liu, Yi Wang, Zhiyuan Shi, Meiping Zhang, and Chunyu Sun

Research Center for Ginseng Genetic Resources Development and Utilization, College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China

Plant stem cells are the cells that are located in meristems and are kept in a state of undifferentiation. Plant stem cell possesses lower vacuolization, higher mitochondrial activity, more genetic stability and stronger self-renewal capacity compared with calli. Plant stem cell culture has a wide application in pharmaceutical, functional food as well as cosmetic industries. Here we describe the procedure of induction, isolation and identification of plant stem cells, to provide a reference for further research in this field.

plant, stem cell, meristem, shoot apical, root apical, culture

January 31, 2018;

April 25, 2018

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2013AA102604-3).

Chunyu Sun. Tel: +86-431-84531640; E-mail: s_ch_y@126.com

10.13345/j.cjb.180047

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2013AA102604-3) 資助。

2018-05-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180516.1027.002.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)