林甦 黃敬之

摘要：目的 觀察玉屏風(fēng)散對(duì)變應(yīng)性鼻炎（AR）鼻黏膜上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用卵清白蛋白致敏建立AR大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和玉屏風(fēng)散低、中、高劑量組。采用AR行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，HE染色觀察大鼠鼻黏膜形態(tài)；ELISA測(cè)定大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10、免疫球蛋白E（IgE）和干擾素-γ（IFN-γ）含量，Western blot、RT-PCR檢測(cè)大鼠鼻黏膜Toll樣受體4（TLR4）和核因子（NF）-κB p65蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4、IL-5、IgE含量顯著升高，IL-10和IFN-γ含量顯著降低（P<0.01），鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散中、高劑量組大鼠血清IL-4、IL-5、IgE含量顯著降低，IL-10和IFN-γ含量顯著升高（P<0.05，P<0.01），鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 玉屏風(fēng)散可能通過(guò)調(diào)節(jié)模型大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子，而起到治療AR的作用。

關(guān)鍵詞：變應(yīng)性鼻炎；玉屏風(fēng)散；TLR4/NF-κB信號(hào)通路；免疫因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.013

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）12-0048-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Yupingfeng Powder on TLR4/NF-κB signaling pathway in allergic rhinitis nasal epithelial cells； To discuss its mechanism of action. Methods AR rat models were established by using ovalbumin sensitization. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group and Yupingfeng Powder low-， medium- and high-dosage groups. After modeling， the AR behavioral index was used for scoring， and nasal mucosa by HE staining were observed. Serum IL-4， IL-5， IL-10， IgE and IFN-γ levels in rats were detected by ELISA. Western blot and RT-PCR were used to detect proteins and gene expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4） and NF-κB p65 in nasal mucosa. Results Compared with the normal group， the contents of IL-4， IL-5， IgE and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in the model group increased significantly， IL-10 and IFN-γ decreased significantly （P<0.01） and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in nasal mucosa increased significantly （P<0.01）； Compared with the model group， the contents of IL-4， IL-5 and IgE in Yupingfeng Powder medium- and high-dosage groups decreased significantly IL-10 and IFN-γ decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in nasal mucosa increased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yupingfeng Powder has a certain therapeutic effect on AR by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway and inflammatory cytokines in model rats.

Keywords： allergic rhinitis； Yupingfeng Powder； TLR4/NF-κB signaling pathway； immune factor； rats

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又稱(chēng)過(guò)敏性鼻炎，是一種吸入變應(yīng)原而導(dǎo)致的以鼻黏膜嗜酸性顆粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)誘發(fā)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)炎性疾病，其主要臨床特征是鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進(jìn)和鼻黏膜腫脹等。AR發(fā)病與多種因素相關(guān)，病因復(fù)雜。目前大多數(shù)研究表明，AR病理生理變化主要由炎性介質(zhì)引發(fā)，免疫細(xì)胞分泌炎癥因子參與AR發(fā)病的復(fù)雜模式，但其發(fā)病機(jī)制尚未徹底闡明[1-2]。近年來(lái)隨著人們生活方式和生活環(huán)境的改變，AR發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。本研究采用卵清白蛋白致敏建立AR大鼠模型，觀察玉屏風(fēng)散對(duì)AR鼻黏膜上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于室溫（25 ℃）、相對(duì)濕度45%～55%環(huán)境，12 h/12 h明暗交替，常規(guī)喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥物及制備

玉屏風(fēng)散（黃芪380 g，麩炒白術(shù)120 g，防風(fēng)60 g），飲片均由福州同春中藥有限公司提供。將防風(fēng)提取揮發(fā)油后與黃芪、麩炒白術(shù)加8倍水合煎，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，合并2次煎液。70%乙醇進(jìn)行藥渣沉淀，取上清液，減壓濃縮加水適量，混勻、靜置。取上清液，過(guò)濾，經(jīng)減壓濃縮與冷凍干燥后凍干成粉，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10、IgE和干擾素-γ（IFN-γ）ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）抗體，美國(guó)Cell signling公司；RNA提取試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；PCR試劑盒，日本Takara公司。Power Wave XS2 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司），SLEE冷凍切片機(jī)（德國(guó)），DX45顯微鏡（日本奧林巴斯），THZ-312型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），PCR儀、Smartspec Plus核酸蛋白測(cè)定儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和玉屏風(fēng)散低（6 g/kg）、中（12 g/kg）、高（24 g/kg）劑量組。參照文獻(xiàn)[3]方法制作AR大鼠模型。以0.3 mg卵清白蛋白為抗原，以30 mg Al（OH）3為佐劑，溶于1 mL生理鹽水制成混懸液，腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，隔日1次，連續(xù)8次，共15 d。第16日開(kāi)始，采用微量加樣器經(jīng)鼻滴入50 μL卵清白蛋白（10 mg/100 μL），連續(xù)7 d，強(qiáng)化致敏。最后1次滴鼻給藥后立即觀察大鼠30 min內(nèi)打噴嚏和撓鼻的次數(shù)，按AR行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，總分≥5分表示造模成功[4]。玉屏風(fēng)散各劑量組給予相應(yīng)濃度藥液灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)10 d。

2.2 大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

鼻癢程度：輕擦外鼻幾次，計(jì)1分；抓撓鼻面不止，到處摩擦計(jì)2分；噴嚏次數(shù)：1～3個(gè)計(jì)1分，4～10個(gè)計(jì)2分，11個(gè)以上計(jì)3分；流涕：流至前鼻孔計(jì)1分，超過(guò)前鼻孔計(jì)2分，流涕滿(mǎn)面計(jì)3分。總分>5分為造模成功[5]。

2.3 大鼠鼻黏膜形態(tài)觀察

末次給藥后，10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，從鼻背部正中縫處裂開(kāi)鼻腔，快速取出鼻黏膜，10%中性緩沖液福爾馬林對(duì)腦組織進(jìn)行固定，常規(guī)冰凍切片，采用乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片（厚約3 μm），HE染色，鏡下觀察。

2.4 大鼠血清炎癥因子含量測(cè)定

末次給藥后，10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，室溫放置1 h，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取上清液，置于1.5 mL EP管。ELISA測(cè)定血清IL-4、IL-5、IL-10、IgE和IFN-γ含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.5 Western blot檢測(cè)大鼻黏膜核因子-κB p65和Toll樣受體4蛋白表達(dá)

稱(chēng)取適量大鼠鼻黏膜，液氮研磨，按10∶1比例加入組織蛋白裂解液，再加入廣譜的磷酸酶抑制劑（1∶100）和PMSF（1∶100），冰浴放置2 h，振蕩，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。計(jì)算出相應(yīng)的上樣量并加入相應(yīng)的緩沖鹽，然后加熱變性10 min，行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%胎牛血清封閉2 h，加入一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗5 min×3次，加入熒光二抗進(jìn)行曝光，采用Image Studio軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠鼻黏膜核因子-κB p65和Toll樣受體4基因表達(dá)

稱(chēng)取適量大鼠鼻黏膜，液氮研磨勻漿，采用Trizol法提取鼻黏膜總RNA。將提取總RNA（8 μL）加反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合（共20 μL），合成cDNA。然后按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行qPCR，檢測(cè)鼻黏膜NF-κB p65、TLR4 mRNA的表達(dá)，Tanon-2500凝膠圖像分析系統(tǒng)分析凝膠結(jié)果，BI-2000圖像分析系統(tǒng)計(jì)算相應(yīng)蛋白mRNA與β-actin mRNA積分吸光度比值，作為其相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

正常組大鼠活動(dòng)、飲食等均正常，無(wú)打噴嚏、流鼻涕、抓撓鼻等AR特征。模型組大鼠在局部致敏當(dāng)日均出現(xiàn)不同程度撓鼻、流鼻涕等現(xiàn)象，造模10 min后最明顯，40 min后所有癥狀基本消失。隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組癥狀逐漸加重，出現(xiàn)典型AR特征，第5日后正常組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明造模成功。玉屏風(fēng)散各劑量組AR特征均明顯改善。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 大鼠鼻黏膜形態(tài)觀察結(jié)果

正常組大鼠鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)完整，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，未見(jiàn)明顯組織及腺體增生；模型組大鼠鼻黏膜上皮組織有明顯的脫落現(xiàn)象，黏膜固有層見(jiàn)大量嗜酸性顆粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)不同程度組織水腫，小動(dòng)脈血管擴(kuò)張及血漿滲出，并伴有腺體增生；玉屏風(fēng)散各劑量組大鼠鼻黏膜病理特征均有改善，上皮組織部分脫落，并有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其整體狀況明顯優(yōu)于模型組。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.3 玉屏風(fēng)散對(duì)模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含量顯著升高，IL-10和IFN-γ含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散中、高劑量組IL-4、IL-5和IgE水平顯著降低，IL-10和IFN-γ水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4.4 玉屏風(fēng)散對(duì)模型大鼠鼻黏膜Toll樣受體4和核因子-κB p65蛋白和基因表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散中、高劑量組大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3～圖6。

5 討論

AR屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，歷代醫(yī)學(xué)家將其病因病機(jī)歸屬于肺、脾、腎三臟虛損，外由風(fēng)寒異氣之邪侵襲。臨床研究也表明AR為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜[6]。本虛多責(zé)之于肺、脾、腎虛，肺氣虛弱多貫穿于鼻鼽的始終。玉屏風(fēng)散方中防風(fēng)遍行周身，上清頭面七竅，內(nèi)除骨節(jié)痛痹，外解四肢攣急，為風(fēng)藥中之潤(rùn)劑，治風(fēng)獨(dú)取此味，任重功專(zhuān)。然衛(wèi)氣者，所以溫分肉而充皮膚，肥腠理而司開(kāi)合。惟黃芪能補(bǔ)三焦而實(shí)衛(wèi)，為玄府御風(fēng)之關(guān)鍵，且有汗能止，無(wú)汗能發(fā)，功同桂枝，故又能除頭目風(fēng)熱，大風(fēng)癩疾，腸風(fēng)下血，婦人子臟風(fēng)，是補(bǔ)劑中之風(fēng)藥也。所以防風(fēng)得黃芪，其功愈大耳。白術(shù)健脾胃，溫分肉，培土即以寧風(fēng)。夫以防風(fēng)之善驅(qū)風(fēng)得黃芪以固表，則外有所衛(wèi)；得白術(shù)以固里，則內(nèi)有所據(jù)，風(fēng)邪去而不復(fù)來(lái)。

本研究通過(guò)卵清白蛋白激發(fā)Wistar大鼠建立AR模型，通過(guò)行為學(xué)評(píng)分和鼻黏膜HE染色對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示模型組大鼠出現(xiàn)明顯AR特征，表明造模成功；當(dāng)連續(xù)予玉屏風(fēng)散15 d后，玉屏風(fēng)散中、高劑量組模型大鼠臨床特征有所改善。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)模型成功與否，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其鼻黏膜進(jìn)行HE染色，病理顯示模型組大鼠鼻黏膜上皮組織有明顯脫落現(xiàn)象，黏膜固有層見(jiàn)大量的嗜酸性顆粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)不同程度的組織水腫，小動(dòng)脈血管擴(kuò)張及血漿滲出，并伴有腺體增生。當(dāng)給予玉屏風(fēng)散后，各給藥組大鼠鼻黏膜病理特征均有改善，亦有部分脫落，并有少量的炎性細(xì)胞，其整體狀況明顯優(yōu)于模型組，其中高劑量組改善效果最明顯，已趨近正常組水平。

機(jī)體免疫中Toll樣受體（TLR）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞的跨膜蛋白，在病原體識(shí)別中發(fā)揮著重要作用[7]。TLR表達(dá)于哺乳動(dòng)物的免疫細(xì)胞表面，能特異性識(shí)別病原微生物進(jìn)化中特定的病原體。呼吸道鼻黏膜上的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、黏膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上分布有不同的TLR亞型，不同亞型能針對(duì)特定微生物感染源產(chǎn)生免疫應(yīng)答。當(dāng)特應(yīng)性個(gè)體接觸致敏原后，導(dǎo)致Thl/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，Th2型細(xì)胞因子表達(dá)量在其疾病發(fā)生過(guò)程中均異常增高，對(duì)于該病的發(fā)生起著重要作用。有研究表明，當(dāng)給予哮喘模型小鼠一定劑量脂多糖刺激后，小鼠體內(nèi)Th2水平顯著增加；但在TLR4基因敲除小鼠中，卻未能發(fā)現(xiàn)Th2水平的升高。此外，有研究顯示，活化的TLR4能激活下游的NF-κB信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的重要核轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)調(diào)節(jié)免疫和炎性相關(guān)因子及炎性介質(zhì)之間的級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，在炎性和免疫反應(yīng)中起樞紐作用，在許多信號(hào)通路傳導(dǎo)中起核心作用，參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控[8-9]。

近年研究認(rèn)為，TLR4/NF-κB信號(hào)通路在AR發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。TLR4通過(guò)與外源性配體結(jié)合后活化TLR4-MyD88依賴(lài)性途徑，進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路。活化的NF-κB亞基p65能直接作用于轉(zhuǎn)錄元件進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而啟動(dòng)一系列免疫相關(guān)基因，如前炎性介質(zhì)、黏附分子、趨化因子等轉(zhuǎn)錄程序，使其表達(dá)量增加，促進(jìn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)或加重炎癥發(fā)生[8]。此外，活化的NF-κB p65通過(guò)啟動(dòng)核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞比例增多；Th2淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子主要是IL-4、IL-5，介導(dǎo)機(jī)體體液免疫。當(dāng)機(jī)體Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ不足時(shí)導(dǎo)致Th2功能亢進(jìn)，誘發(fā)IL-4、IL-5過(guò)多產(chǎn)生。其中IL-4能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IgE，誘發(fā)AR。IL-5為機(jī)體維持和延續(xù)速發(fā)性變態(tài)反應(yīng)形成炎癥主要炎性介質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)AR的典型病理改變。IL-10是由Tr1細(xì)胞分泌的抗炎因子，可抑制炎性細(xì)胞合成，用來(lái)探究和評(píng)價(jià)藥物的治療效果。

本研究通過(guò)測(cè)定大鼠血清IL-4、IL-5、IL-10、IgE和IFN-γ水平變化，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含量均顯著升高，IL-10和IFN-γ含量顯著降低；當(dāng)給予玉屏風(fēng)散干預(yù)后，各給藥組大鼠血清炎癥因子水平均有所回調(diào)，其中，玉屏風(fēng)散中、高劑量組IL-4、IL-和IgE含量顯著降低，IL-10和IFN-γ含量顯著升高，表明玉屏風(fēng)散對(duì)AR引發(fā)的炎癥因子水平異常有明顯改善作用。為進(jìn)一步探究玉屏風(fēng)散對(duì)TLR4和NF-κB信號(hào)通路的改善作用，對(duì)各組大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明玉屏風(fēng)散能顯著調(diào)節(jié)TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表達(dá)，對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有顯著調(diào)節(jié)作用，且呈劑量依賴(lài)性。

綜上所述，TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AR的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色；玉屏風(fēng)散可能通過(guò)調(diào)節(jié)模型大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎性因子，起到治療AR的作用。

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