溫家欣, 吳鳳丹, 曹雅靜, 何嘉雯, 黃志業(yè), 黃艷婷, 譚婉清, 羅文靜, 賴宇紅

(廣東省藥品檢驗(yàn)所, 廣東 廣州 510663)

蜂膠是工蜂采集植物樹(shù)脂等分泌物后與自身上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的膠黏性物質(zhì)[1]。蜂膠是傳統(tǒng)中藥,具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝、抗癌等[2],廣泛應(yīng)用于保健食品、藥品和化妝品等行業(yè)中,是近十多年來(lái)蜂產(chǎn)品乃至天然產(chǎn)物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[3]。自2002年我國(guó)出口歐盟的蜂蜜檢出氯霉素后,我國(guó)蜂產(chǎn)品的出口貿(mào)易形勢(shì)比較嚴(yán)峻,蜂產(chǎn)品中的獸藥殘留問(wèn)題已成為影響其食用安全最主要的因素,成為學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。

氯霉素是一種廣譜抗生素,是預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾病的有效藥物之一。但由于氯霉素能在蜂產(chǎn)品中殘留,對(duì)人類的造血系統(tǒng)有嚴(yán)重不良反應(yīng),許多國(guó)家已將其列入食品中禁止使用的藥物名單[4]。目前,關(guān)于蜂蜜、蜂王漿及其相關(guān)制品中氯霉素殘留量檢測(cè)方法的報(bào)道較多,主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5,6]、氣相質(zhì)譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等,但關(guān)于蜂膠及以其為原料的保健食品的報(bào)道較少[4,9-11]。對(duì)于蜂膠原料,普遍采用氫氧化鈉溶液、乙醇、甲基叔丁基醚溶解,以乙酸鉛溶液、氫氧化鈉溶液為沉淀劑去除黃酮,最后以乙酸乙酯萃取的方法進(jìn)行前處理[4,9,10]。對(duì)于以蜂膠為原料的保健食品,其主要?jiǎng)┬蜑檐浤z囊和硬膠囊,由于制劑輔料(如聚乙二醇400、明膠、甘油、植物油、淀粉、微晶纖維素等)的加入,其樣品基質(zhì)更為復(fù)雜。對(duì)于軟膠囊劑,部分輔料(如聚乙二醇400)的添加量較大,溶解特性與氯霉素相似,使用常用的氯霉素提取溶劑(乙酸乙酯、乙腈等)將產(chǎn)生較嚴(yán)重的共提取,導(dǎo)致樣品難以濃縮[11],影響方法的靈敏度和抗干擾性;對(duì)于硬膠囊劑,部分輔料(如淀粉、微晶纖維素等)遇極性較低的有機(jī)溶劑容易產(chǎn)生膠狀物,不利于氯霉素的提取。因此,選擇合適的提取溶劑、凈化手段和萃取溶劑,是前處理方法研究的重點(diǎn)。

本文根據(jù)蜂膠原料及以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)特點(diǎn),開(kāi)發(fā)了一個(gè)同時(shí)適用于這兩類樣品的氯霉素測(cè)定方法。本方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確、推廣應(yīng)用前景良好的優(yōu)點(diǎn),為蜂膠產(chǎn)品氯霉素殘留監(jiān)管問(wèn)題提供了有效的技術(shù)支撐手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20ADXR液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司), Triple Quad 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(配ESI)(美國(guó)Sciex公司), MS 3 digital渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司), ST16R離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司), Hei-VAP Advan旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Heidolph公司), Mili-Q Advantage A10超純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAP,純度99.0%)和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(CAP-D5, 100 mg/L)(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);無(wú)水乙醇、三水合乙酸鉛、冰醋酸、氨水、正己烷(分析純,廣州光華試劑廠);甲基叔丁基醚和乙腈(色譜純,美國(guó)Honeywell公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1HPLC-MS/MS條件

色譜柱:Thermo Accucore C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:A為水,B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 20%B; 2.0～5.0 min, 20% B～90%B; 5.0～7.0 min, 90%B; 7.0～7.5 min, 90%～20%B; 7.5～10.0 min, 20%B。

采用ESI源,負(fù)離子模式檢測(cè)。電噴霧電壓:-4 500 V;離子源溫度:550 ℃;霧化氣壓力:3.447 5×105Pa;氣簾氣壓力:2.758×105Pa;碰撞氣壓力:6.205 5×104Pa;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表 1 氯霉素、氯霉素-D5 的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

1.2.2溶液配制

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)乙酸鉛溶液:稱取20 g三水合乙酸鉛,用水溶解,加入2.5 mL冰醋酸,加水至500 mL,混勻。

準(zhǔn)確稱取10 mg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈配成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取適量氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液,用乙腈稀釋成100 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

取適量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作溶液,用乙腈-水(1∶1, v/v)配制成氯霉素質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L、內(nèi)標(biāo)氯霉素-D5質(zhì)量濃度為10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3樣品前處理

將蜂膠原膠置于-18 ℃冷凍2 h,取出后立即敲碎,敲碎后的樣品作為供試樣品。以蜂膠為原料的保健食品直接取膠囊內(nèi)容物。

稱取試樣2.00 g,置于50 mL離心管中,加入100 μL氯霉素-D5工作溶液(100 μg/L)和無(wú)水乙醇(蜂膠、硬膠囊加4 mL,軟膠囊加2 mL),渦旋振蕩10 min(硬膠囊經(jīng)無(wú)水乙醇提取后需以8 000 r/min的速度離心10 min,上清液用濾紙過(guò)濾至另一50 mL離心管中,濾紙上的殘?jiān)?～2 mL無(wú)水乙醇洗滌,濾液備用)。加入10 mL水,渦旋3 min,再加入10 mL 4%乙酸鉛溶液,渦旋3 min,以8 000 r/min的速度離心5 min。上清液傾入另一50 mL離心管中,殘?jiān)尤? mL 4%乙酸鉛溶液,渦旋3 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,合并上清液于同一50 mL離心管。上述清液用氨水調(diào)節(jié)pH至10～11,混勻后靜置5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min。上清液傾入50 mL離心管中,加入10 mL正己烷,渦旋振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,棄去上層溶液。再加入10 mL甲基叔丁基醚,渦旋振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心5 min,取上層清液于雞心瓶。重復(fù)提取1次,合并提取液于同一雞心瓶。于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入1 mL乙腈-水(1∶1, v/v)復(fù)溶。復(fù)溶液通過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜至樣品瓶,待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

蜂膠可溶于2%氫氧化鈉溶液、乙醇[9],氯霉素易溶于甲醇、乙醇、丁醇、乙酸乙酯、丙酮。由于硬膠囊劑一般使用淀粉作為內(nèi)容物輔料,使用2%氫氧化鈉溶液、0.5%氫氧化鈣懸濁液[11]處理,會(huì)使淀粉發(fā)生糊化,導(dǎo)致氯霉素包裹其中,嚴(yán)重影響試樣中氯霉素的提取。而無(wú)水乙醇能有效溶解蜂膠,但不溶解硬膠囊劑常用輔料(淀粉、微晶纖維素等)和軟膠囊劑常用輔料(明膠),通過(guò)離心、過(guò)濾即可去除大量輔料成分的共提取。為提高前處理方法的通用性,降低后續(xù)凈化處理的難度,本方法采用無(wú)水乙醇對(duì)蜂膠及以蜂膠為原料的保健食品中的氯霉素進(jìn)行提取。

2.2 凈化方式的選擇

蜂蜜、蜂王漿樣品的凈化過(guò)程主要采用液液萃取[6,12,13]、固相萃取[14-16]、液液萃取與固相萃取相結(jié)合[5,17]、QuEChERS[18,19]等方式凈化。但由于蜂膠的成分與蜂蜜、蜂王漿有很大的差別,基質(zhì)更加復(fù)雜,使用液液萃取的方式不能除去蜂膠中的大量黃酮類成分[4]。以蜂膠為原料的軟膠囊劑保健食品,由于制劑輔料(如聚乙二醇400、甘油)的大量加入,使氯霉素在固相萃取柱、分子印跡柱中的保留行為發(fā)生變化。因此,本方法采用4%乙酸鉛溶液沉淀具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物[4],在堿性條件下進(jìn)一步去除不含此結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物[9],同時(shí),堿性條件下更利于后續(xù)有機(jī)溶劑對(duì)氯霉素的萃取。另外,由于蜂膠約含30%蜂蠟,以蜂膠為原料的軟膠囊劑保健食品常以植物油(如大豆油、玉米油等)作為輔料,因此本方法使用正己烷去除樣品中蠟質(zhì)、脂類及脂溶性雜質(zhì)的干擾。

2.3 萃取溶劑的選擇

針對(duì)氯霉素常用的萃取溶劑主要有乙酸乙酯、乙腈、堿性乙酸乙酯和堿性乙腈[20]。對(duì)于軟膠囊劑,聚乙二醇400是常用的制劑輔料,是一種非離子型的水溶性聚合物,在極性較大的溶劑中有很好的溶解性,且添加量較大,使用乙酸乙酯、乙腈等作為萃取溶劑會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的共提取,導(dǎo)致樣品難以濃縮[11],影響方法的靈敏度,帶來(lái)嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。因此,選擇一種合適的萃取溶劑至關(guān)重要。本方法采用甲基叔丁基醚作為溶劑,在堿性條件下對(duì)凈化液中的氯霉素進(jìn)行萃取,有效減少樣品中極性干擾物和制劑輔料(聚乙二醇400、甘油等)的共提取。

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

配制質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以氯霉素與氯霉素-D5的峰面積比值為縱坐標(biāo)y、氯霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x(單位:μg/L)進(jìn)行線性回歸,回歸方程為y=0.083 9x-0.011 9,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8,線性關(guān)系良好。在空白基質(zhì)溶液中添加不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,按取樣量2.0 g、定容體積為1 mL計(jì)算,當(dāng)信噪比(S/N)≥3時(shí),氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.06 μg/L,方法檢出限為0.03 μg/kg;當(dāng)S/N≥10時(shí),氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.20 μg/L,方法定量限為0.1 μg/kg。

2.5 方法學(xué)考察

由于蜂膠原料、以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)差異較大,保健食品不同劑型的制劑輔料的組成差異顯著,應(yīng)分別對(duì)蜂膠原膠、以蜂膠為原料的保健食品(硬膠囊劑)、以蜂膠為原料的保健食品(軟膠囊劑)3類樣品進(jìn)行考察。其中,由于軟膠囊劑中常見(jiàn)的制劑輔料聚乙二醇400與蜂蠟、植物油等低極性輔料不配伍,所以以蜂膠為原料的軟膠囊通常有兩種輔料配伍方式,一種是含有聚乙二醇400但不含蜂蠟、植物油等低極性物質(zhì),另一種是含有蜂蠟、植物油但不含聚乙二醇400。本文對(duì)上述4種基質(zhì)進(jìn)行考察,各基質(zhì)在低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收率見(jiàn)表2,回收率為86.0%～114.4%。

PEG 400: polyethylene glycol 400.

2.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提取干擾物與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致[21]。為評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),本文使用4種不同基質(zhì)的空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度為0.20～50.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%進(jìn)行評(píng)價(jià),負(fù)值表示存在抑制效應(yīng),正值表示存在增強(qiáng)效應(yīng),絕對(duì)值越大表示基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[22]。由表3可見(jiàn),不同基質(zhì)的樣品,基質(zhì)效應(yīng)均小于7%,表明基質(zhì)效應(yīng)較弱,本方法具有良好的凈化效果。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)5批不同廠家蜂膠原料、18批以蜂膠為主要原料的保健食品進(jìn)行檢測(cè)。其中,蜂膠原料均未檢出氯霉素;5批以蜂膠為原料的保健食品(1批硬膠囊和4批軟膠囊)檢出氯霉素,陽(yáng)性率為27.7%,含量為0.23～21.66 μg/kg,結(jié)果見(jiàn)表4。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液及典型樣品提取離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

表 3 4種不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

表 4 23批樣品中氯霉素含量測(cè)定結(jié)果

表 4 (續(xù))

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圖 1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液及典型樣品提取離子流(XIC)色譜圖

3 結(jié)論

本文根據(jù)蜂膠原料及以蜂膠為原料的保健食品的基質(zhì)特點(diǎn),開(kāi)發(fā)了同時(shí)適用于這兩類樣品的氯霉素測(cè)定方法。以乙酸鉛溶液沉淀具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物,在堿性條件下進(jìn)一步去除不含此結(jié)構(gòu)的黃酮類干擾物,并以甲基叔丁基醚為提取溶劑,有效減少樣品中極性干擾物和保健食品輔料(如聚乙二醇、甘油等)的共提取,具有通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、推廣應(yīng)用前景良好的優(yōu)點(diǎn),可滿足實(shí)際檢驗(yàn)工作的需要。