石曉磊，齊田苗，邊海霞，周云鋒

(1.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

支原體是一類無細(xì)胞壁，僅由胞漿膜包裹的介于細(xì)菌和病毒之間的原核生物，直徑約為0.1 μm。在固體培養(yǎng)基上可形成“煎蛋樣”菌落[1]，體外培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求苛刻。支原體自然感染的宿主范圍廣且具有一定的宿主特異性，主要侵害哺乳動物和禽類的生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，還可引發(fā)乳腺炎、關(guān)節(jié)炎及眼部感染[2]。支原體的研究開始于法國Nocard和Roux在1898年首次從患有牛傳染性胸膜肺炎的牛肺組織中分離得到此種微生物，之后相繼從山羊、禽、犬類中分離到此類微生物[3]。近年發(fā)現(xiàn)的支原體已超過100多種，均屬于柔膜菌綱支原體目、支原體科[4]。報(bào)道過的對禽有致病性的支原體有28種，其中危害最大的有3種，即雞毒支原體、雞滑液囊支原體和火雞支原體。以雞毒支原體和滑液囊支原體感染最為嚴(yán)重[5]?；耗抑гw可引起雞和火雞的傳染性滑液囊炎、慢性呼吸系統(tǒng)疾病及雞蛋尖端綜合征[6]?；耗抑гw傳染性極強(qiáng)，感染率較高，病雞和隱性感染雞群是該病的傳染源。感染滑液囊支原體會導(dǎo)致雞群的飼料轉(zhuǎn)化率降低，蛋的質(zhì)量也會受到影響，由于發(fā)病雞抵抗力下降，導(dǎo)致死淘率升高[7]。自發(fā)病以來，雞滑液囊支原體病已經(jīng)對寧夏地區(qū)的蛋種雞行業(yè)危害甚大。本試驗(yàn)通過分離培養(yǎng)當(dāng)?shù)氐木辏⑼ㄟ^藥敏試驗(yàn)篩選出幾種敏感藥物，為滑液囊支原體病的藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料的采集 2017年9月至2017年12月期間，在寧夏地區(qū)養(yǎng)殖場共觀察到了87只具有典型的腿關(guān)節(jié)腫脹并伴有慢性呼吸道病癥狀的病雞，無菌采集病雞的跗關(guān)節(jié)內(nèi)容物和抓墊內(nèi)容物，經(jīng)過分離培養(yǎng)和鑒定，成功分離到共13株滑液囊支原體菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良Frey氏培養(yǎng)基，北京中海生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 抗菌藥物 酒石酸泰萬菌素，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：E13116906)；延胡索酸泰妙菌素，上海禮來公司產(chǎn)品(批號：B399969)；土霉素，河北健民公司產(chǎn)品(批號：8160773)；磷酸替米考星，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：K81170414)；酒石酸泰樂菌素，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：A91171008)；替米考星，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：H71161122)；氟苯尼考，上海禮來公司產(chǎn)品(批號：C793518)；鹽酸多西環(huán)素，浙江伊科拜克公司產(chǎn)品(批號：170304)；恩諾沙星，四川拜耳制藥(批號：CN36901)。

1.2 方法

1.2.1 采樣部位及分離培養(yǎng) 取發(fā)病初期的病雞腿關(guān)節(jié)和抓墊，消毒徹底后取關(guān)節(jié)內(nèi)容物置于9 mL改良Frey液體培養(yǎng)基內(nèi)，加蓋后放置在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察2次，待培養(yǎng)基顏色變黃后，按1∶10的比例接種到新的培養(yǎng)基中，穩(wěn)定傳代3次后，將培養(yǎng)液接種在改良Frey氏固體培養(yǎng)基，每個(gè)平板接種100 μL，涂勻加蓋后放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d～7 d，每天觀察菌落的生長情況，待肉眼可見固體培養(yǎng)基上有菌落生長，置低倍顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落，挑取單個(gè)菌落到新的液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)48 h后菌液可進(jìn)行下一步的PCR檢測。

1.2.2 病變關(guān)節(jié)腔滲出物的常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定 無菌采集病雞的跗關(guān)節(jié)液，接種于MHA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h。無菌采病雞喉頭拭子接種于MHA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，染色后觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 PCR檢測 根據(jù)OIE推薦的MS檢測引物序列設(shè)計(jì)了引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為185 bp。上游引物MS-F:5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；下游引物MS-R:5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′。試劑盒法提取模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Taq酶購自寶生物(大連)有限公司。PCR體系：10 μL 2×mix，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，加雙蒸水補(bǔ)足20 μL，將以上成分混合后，置于PCR機(jī)中，94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃(檢測引物為53℃)退火30 s，72℃延伸1 min；共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。

1.2.4 抗菌藥物的稀釋 無菌稱取抗菌藥物溶于稀釋液中，無菌操作配制成濃度為10 mg/mL的原液，再用液體培養(yǎng)基將藥液稀釋至1 mg/mL，每種藥物取1 mL,38℃培養(yǎng)3 d觀察有無真菌或細(xì)菌污染。

1.2.5 常用抗菌藥物最小抑菌濃度的測定 從寧夏地區(qū)分離鑒定的13株MS，每個(gè)分離地隨機(jī)選取1株進(jìn)行MIC(minimal inhibitory concentration)測定。在滅菌EP管中分別加入改良Frey氏液體培養(yǎng)基0.37 mL，每組21個(gè)梯度，于每組的第1管依次分別加入上述稀釋并除菌的抗生素各0.37 mL，然后按1∶1倍比稀釋至第21管后棄去多余的0.35 mL，接著各孔加入40 μL待測菌液。第22管作為陰性對照(培養(yǎng)基0.3 mL)，第23管作為藥物對照(培養(yǎng)基2 mL+抗生素0.5 mL)，第24管(培養(yǎng)基2 mL+200 μL待測菌液)不加抗生素作陽性對照。稀釋好的菌-藥液移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加蓋后置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：第22管和23管不變色，24管由原來的紅色變?yōu)辄S色且清澈透明，讀取試驗(yàn)孔的顏色變化，記錄無滑液囊支原體生長的最大稀釋倍數(shù)，根據(jù)藥物稀釋濃度計(jì)算菌株的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 滑液囊支原體的分離鑒定

2.1.1 常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定 剖檢腿關(guān)節(jié)腫脹的病雞，用無菌拭子采集關(guān)節(jié)腔膿液，涂布在MHA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.1.2 滑液囊支原體的固體培養(yǎng)和菌落特征 將菌液涂布在改良Frey氏固體培養(yǎng)基平板上，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃靜置培養(yǎng)，低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)第4天有菌落小、光滑、圓形、稍平，并具有一個(gè)較致密的中央隆起的呈“煎蛋樣”的菌落(圖1)。

圖1 低倍鏡下的菌落特征(10×10)

2.1.3 常規(guī)細(xì)菌分離 用無菌的操作采集雞的病變關(guān)節(jié)滲液， 接種于MHA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h，結(jié)果未見菌落生長。

2.1.4 分子生物學(xué)診斷 取病變關(guān)節(jié)滲出液提取DNA，選擇OIE規(guī)定的檢測引物PCR擴(kuò)增MS的特異性基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見185 bp左右的特異條帶(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～8.分離株；9.陰性對照；10～14.分離株

M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Isolates;9.Blank control;10-14.Isolates

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis diagram of PCR products

2.2 MIC的測定

選擇最常見的幾種藥物和3株雞滑液囊支原體分離株，測定每種藥物的最小抑菌濃度，MIC結(jié)果見表1，結(jié)果顯示，酒石酸泰萬菌素的敏感性最高，藥物MIC值在0.04 μg/mL左右；泰樂菌素、泰妙菌素敏感性次之，MIC值為0.12 μg/mL～0.22 μg/mL；磷酸替米考星、鹽酸林可霉素大觀霉素、多西環(huán)素，MIC值為1.95 μg /mL～7.81 μg /mL；土霉素和氟苯尼考的敏感性最差，在15.63μg/mL～31.25 μg/mL。

3 討論

盡管雞滑液囊支原體病在寧夏地區(qū)普遍流行，但對本病病原的分離鑒定和相關(guān)的研究卻很少，本研究從寧夏地區(qū)感染雞滑液囊支原體病的蛋種雞場采集發(fā)病雞的跗關(guān)節(jié)和爪墊并成功分離培養(yǎng)到13個(gè)菌落小、光滑、圓形、稍平，并具有一個(gè)較致密的中央隆起的呈“煎蛋樣”的菌落[9]。挑取單菌落液體培養(yǎng)，可導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色的變化但不渾濁，根據(jù)OIE推薦設(shè)計(jì)了一對引物，提取分離菌的核酸經(jīng)PCR鑒定為MS陽性，與丁美娟等結(jié)論相符合[10]。

表1 藥物對3株分離株的最小抑菌濃度

本研究改進(jìn)了傳統(tǒng)的支原體分離方法，滑液囊支原體的分離鑒定周期較長，培養(yǎng)條件也較為苛刻，但結(jié)果可靠準(zhǔn)確，并且能進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對藥物治療有重要的指導(dǎo)意義。

從每個(gè)分離地挑取1個(gè)菌株進(jìn)行常用藥物的藥敏試驗(yàn)，由于支原體的培養(yǎng)特性，普通的藥敏片法和牛津杯法很難評價(jià)藥物的敏感程度，所以選擇更加費(fèi)時(shí)費(fèi)力的微量液體稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度[8]。選擇泰萬菌素、泰妙菌素、替米考星等藥物，從本試驗(yàn)結(jié)果看，在酒石酸泰萬菌素等8種抗生素中，MS-NX-2和MS-NX-3這2株雞滑液囊支原體分離株對酒石酸泰萬菌素的MIC值均為0.03 μg/mL，是所選藥物中效果最好的，其次，酒石酸泰樂菌素和延胡索酸泰妙菌素的也有較高的敏感性，土霉素和氟苯尼考對所有分離菌最不敏感。不同菌株對藥物的敏感性存在一定的差異。本研究中NX-2和NX-3對酒石酸泰萬菌素的最低抑菌濃度為0.03 μg/mL，而MS-NX-1分離株對酒石酸泰萬菌素最低抑菌濃度為0.06 μg/mL，此試驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，當(dāng)雞場發(fā)生雞滑液囊支原體病時(shí)，及時(shí)分離菌株，通過測定藥物的最小抑菌濃度有助于藥物的選擇。