成嘉祁，龔蕓蕓，謝海靜，李宏亮，戚龍菊

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)杏林學(xué)院，江蘇南通 226001；3.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通 226001；4.南通大學(xué)護(hù)理學(xué)院，江蘇南通 226001)

美國(guó)2017年癌癥報(bào)告顯示，年度新增肝膽癌癥患者40 710人(男性29 200人，女性11 510人，死亡人數(shù)為28 920人(男性19 610人，女性9 310人)，死亡率占腫瘤死亡率的4.813%[1]。我國(guó)是肝癌高發(fā)的國(guó)家之一，每千人中年度新增患者466.1人(男性343.7人，女性122.3人)，年度死亡人數(shù)為422.1人(男性310.6人，女性111.5人)，占腫瘤死亡率的10.861%[2-3]。肝纖維化(Hepatic fibrosis)常見(jiàn)于肝臟慢性損傷后的修復(fù)過(guò)程，由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成高于降解，進(jìn)而過(guò)度沉積，破壞肝臟結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝臟衰竭，并逐步向肝硬化和肝癌發(fā)展，預(yù)后極差[4]。由于早期診斷手段的缺乏以及癥狀不易察覺(jué)，導(dǎo)致大多數(shù)肝病患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)肝硬化甚至肝癌癥狀，給家庭和社會(huì)醫(yī)療體系造成較大的負(fù)擔(dān)，而國(guó)內(nèi)外目前尚未有有效的治療藥物方法[5-6]。

肝臟的損傷和纖維化會(huì)導(dǎo)致臟器局部循環(huán)減弱，產(chǎn)生缺氧而促進(jìn)病程的惡化[7-9]。低氧環(huán)境和組織纖維化誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，而炎癥又加重缺氧，因此控制局部炎癥反應(yīng)對(duì)于治療和逆轉(zhuǎn)肝纖維化十分必要[10-12]?？祻?fù)治療手段在臨床上已逐步應(yīng)用于腫瘤患者的輔助治療[13-15]，并在動(dòng)物腫瘤模型中獲得了驗(yàn)證[16-17]。其中采用不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組合交替進(jìn)行，組間充分休息的有氧間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練(aerobic interval training，AIT)可以促進(jìn)肝臟局部供氧，改變代謝方式，有效緩解腫瘤患者疲勞，但其在肝纖維化過(guò)程中的作用機(jī)制并未研究清楚[7,18-19]?？傸S酮具有抗氧化、抗炎癥、抗病毒等作用，已有研究報(bào)道表明枳椇子、歐芹根、黃芪及荔枝等植物總黃酮具有治療病毒性和酒精性肝炎的作用[20-22]。青蒿素抗瘧效果顯著，隨之對(duì)青蒿提取物研究方興未艾，但青蒿總黃酮是否對(duì)肝纖維化具有抑制作用并未見(jiàn)報(bào)道。本研究以肝纖維化小鼠為模型，利用青蒿總黃酮聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)的治療方案，觀察二者單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其對(duì)炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 青蒿總黃酮為西安賽邦醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；ConA為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol為南京諾維贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Masson染色試劑盒為索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α檢測(cè)試劑盒為武漢優(yōu)爾生公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 儀器 小鼠實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(ZH-PT)，安徽正華生物儀器有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Eppendorf冷凍離心機(jī)，酶標(biāo)儀。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)Balb/c小鼠60只，4周齡，體重20 g～22 g，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。正常飼養(yǎng)3 d以適應(yīng)環(huán)境。5只/籠，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗周期光照，溫度為22℃～25℃，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及取材操作規(guī)程獲得南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守。

1.2 方法

1.2.1 造模 以12.5 μg/g體重劑量每周一次尾靜脈注射ConA的氯化鈉溶液，持續(xù)8周，最終存活個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨機(jī)抽取3只小鼠進(jìn)行肝纖維化評(píng)價(jià)以確定是否造模成功。

1.2.2 分組與給藥 造模成功后小鼠40只隨機(jī)平均分為總黃酮組(FLA組)，運(yùn)動(dòng)組(TM組)，混合治療組(FTM組)，模型組(Model組)。FLA組0.4 mg/g劑量于每日上午進(jìn)行灌胃；TM組采用AIT方案進(jìn)行跑臺(tái)；FTM組于每日上午以0.4 mg/g的劑量灌胃，下午進(jìn)行AIT跑臺(tái)，運(yùn)動(dòng)方案同TM組；Model組正常飼養(yǎng)。共持續(xù)6周。

1.2.3 運(yùn)動(dòng)方案 AIT處理的小鼠在實(shí)驗(yàn)前以10 m/min步速訓(xùn)練5 d，并測(cè)定最大跑速(Maximal speed)。小鼠先以10 m/min速度熱身5 min，隨之跑臺(tái)速度以3 m/min增加直至小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，疲勞癥狀，以之為最大跑速。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，TM和FTM組小鼠以最大跑速的60%運(yùn)動(dòng)60 min，5 d/周，持續(xù)6周[23]。

1.2.4 動(dòng)物樣本取材 30 mL/L的水合氯醛麻醉小鼠，心臟采血1 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置-80℃?zhèn)溆?；頸椎脫臼處死小鼠，開(kāi)腹，取肝臟組織100 mg，生理鹽水沖洗，置于1.5 mL離心管中，加入1 mL的Trizol，液氮冷凍，置-80℃?zhèn)溆?；取肝臟組織300 mg，生理鹽水沖洗，置于40 mL/L PFA中固定，次日行脫水，透明，浸蠟包埋，做5 μm切片。

1.2.5 Masson染色 烘片2 h，梯度入水。臨用時(shí)取等量的Weigert染液A與Weigert染液B混合成為鐵蘇木素染液，染色6 min；酸性乙醇分化30 s，水洗后返藍(lán)1 min，水洗1 min；麗春紅品紅染色5 min，用弱酸工作液浸泡1 min；磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸溶液浸泡1 min；苯胺藍(lán)染色4 min。弱酸溶液浸泡1 min；用950 mL/L乙醇迅速脫水；無(wú)水乙醇， 30 s×3；二甲苯，5 min×3；封片并鏡檢。

1.2.6 ELISA檢測(cè) IL-1β、IL-10以及TNF-α檢測(cè)按照試劑盒所提供說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作[24]。

1.2.7 Real-time PCR檢測(cè) 常規(guī)Trizol-氯仿法提取各組動(dòng)物肝臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，用熒光定量PCR反應(yīng)Kit對(duì)IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，總循環(huán)40次。從NCBI下載基因序列，使用Primer 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，BLAST預(yù)測(cè)擴(kuò)增特異性。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS22.0分析檢測(cè)所得結(jié)果。各組中死亡小鼠不計(jì)入統(tǒng)計(jì)量。多組間均數(shù)比較采用方差分析；用t檢驗(yàn)方差齊性，不齊者采用矯正t檢驗(yàn)；對(duì)變異較大組比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 肝臟纖維化程度的變化

各組小鼠肝切片Masson染色結(jié)果顯示，Model組小鼠肝臟中膠原纖維(藍(lán)色)表達(dá)量顯著增多，呈現(xiàn)彌漫性，并且互相粘連成片，形成區(qū)域斑塊樣分布，又以血管周?chē)蛥R管區(qū)為主；FLA組藍(lán)色纖維分布較少，主要集中于匯管區(qū)和血管周?chē)t色的肌纖維呈點(diǎn)狀分布；TM組中藍(lán)色膠原纖維表現(xiàn)為散發(fā)性分布，但并未粘連成片，未見(jiàn)斑塊樣區(qū)域；FTM組肝臟組織中偶見(jiàn)些許藍(lán)色纖維，并且纖維長(zhǎng)度較短，寬度較窄(圖1)。

2.2 肝臟組織中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果表明，與Model組相比，F(xiàn)LA組TNF-α的表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，TM組顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.001)。與FLA組相比，F(xiàn)TM組中TNF-α的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與TM組相比，F(xiàn)TM組表達(dá)量則極顯著下降(P<0.01)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-1β的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-1β的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組、TM組及FTM組中IL-6的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-6的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-10的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，而FTM組中則極顯著上升(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-10的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)(表2)。

A.模型組小鼠肝臟切片Masson染色(40×)，比例尺=50μm; B.黃酮組小鼠; C.運(yùn)動(dòng)組小鼠; D.復(fù)合組小鼠，放大倍數(shù)及比例尺同A.

A.Masson staining of the liver sections in model group mice (x40),scale bar=50 μm; B.FLA group; C.TM group; D.FTM group,the parameters were same as A.

圖1各組小鼠肝臟Masson染色(40×)

Fig.1 Masson staining of liver sections in mice of different groups(40×)

2.3 血清中炎癥因子含量的變化

ELISA結(jié)果表明，與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組血清中TNF-α的含量均極顯著下降(P<0.01)，而FTM組則呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.001)。與FLA組和TM組相比，F(xiàn)TM組血清中TNF-α的含量差異顯著(P<0.05)；與Model組相比，F(xiàn)LA組中IL-1β的含量極顯著下降(P<0.01)，TM組中顯著下降(P<0.05)，而FTM組中則極顯著下降(P<0.001)。與FLA組相比，F(xiàn)TM組中IL-1β的含量顯著下降(P<0.05)，與TM組相比，F(xiàn)TM組含量極顯著下降(P<0.01)；與Model組相比，F(xiàn)LA組及TM組中IL-10的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，而FTM組中則極顯著上升(P<0.01)。與FLA組及TM組相比，F(xiàn)TM組中IL-10的含量顯著上升(P<0.05)(表3)。

表2 各組小鼠肝臟組織中炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

注：與模型組比較：1.P<0.05，2.P<0.01 ，3.P<0.001 ；與黃酮組比較：4.P<0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較：5.P<0.05，6.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01,3.P<0.001; Compared with FLA group,4.P<0.05; Compared with the TM group,5.P<0.05,6.P<0.01.

表3 各組小鼠血清中TNFα、IL-1β、IL-10含量的變化

注：與模型組比較：1.P<0.01，2.P<0.001 ；與黃酮組比較：3.P<0.05；與運(yùn)動(dòng)組比較：4.P<0.05，5.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01; Compared with the FLA group,3.P<0.001; Compared with the TM group,4.P<0.05,5.P<0.05.

3 討論

肝癌是世界上第二致死病因，每年全球有超過(guò)70萬(wàn)人因此而死亡[25]。肝癌的發(fā)生過(guò)程中，肝臟纖維化是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，并且肝纖維化評(píng)分與肝臟疾病、肝癌發(fā)生率以及死亡率呈正相關(guān)，因此肝纖維化程度能夠預(yù)示肝癌發(fā)生率[26]。肝臟纖維化往往會(huì)由于病毒、酒精、藥物以及遺傳因素等原因?qū)е赂闻K損傷，造成肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生，進(jìn)而使得彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)部過(guò)度沉積[27]。纖維化通常是各種慢性肝臟疾病發(fā)展的共同結(jié)果，也是肝硬化的必經(jīng)階段，更是肝細(xì)胞癌的前兆和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[28]。由于肝臟纖維化是一個(gè)可逆的過(guò)程，故監(jiān)測(cè)和治療肝纖維化過(guò)程成為攻克肝癌的重要環(huán)節(jié)?；罨母闻K星狀細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源，肝臟中肌成纖維細(xì)胞通過(guò)合成并分泌膠原促進(jìn)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的積累，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[28]。通過(guò)Masson染色可以清晰觀察到各組小鼠肝臟中膠原纖維的發(fā)生情況，模型組纖維化程度最高，總黃酮和運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠有效降低纖維化程度，但二者聯(lián)合使用抵抗肝臟纖維化能力顯著增強(qiáng)。

中藥在慢性病的治療過(guò)程中具有獨(dú)特的優(yōu)越性，肝纖維化在中醫(yī)中被認(rèn)為是由于肝郁氣滯導(dǎo)致血瘀的產(chǎn)生，而血不養(yǎng)肝，因此需要清熱解毒，散淤消腫。鬼針草中黃酮類(lèi)物質(zhì)能夠顯改CCl4引起的大鼠肝纖維化程度，抑制星狀細(xì)胞的活化和增殖[29]。趕黃草總黃酮能夠抑制大鼠酒精性肝纖維化，降低組織中過(guò)氧化物活性和濃度，抑制炎癥因子的表達(dá)[30]。青蒿提取物能夠抑制炎癥反應(yīng)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[31]，但青蒿總黃酮的功能并不清楚。本研究表明，青蒿總黃酮能夠有效抑制肝臟纖維化，并抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，提高抗炎因子IL-10的表達(dá)。

臨床早期康復(fù)訓(xùn)練能夠改善乳腺癌患者術(shù)后體征指數(shù)[13,16]，并提高肝癌患者術(shù)后的排氣和焦慮狀態(tài)[14]，但康復(fù)訓(xùn)練，尤其是AIT對(duì)于肝纖維化改善機(jī)制研究并不清楚。本研究中AIT能夠有效抑制刀豆蛋白A所導(dǎo)致的肝臟纖維化，但治療效果低于青蒿總黃酮組，可能是AIT只進(jìn)行了6周，時(shí)間較短的緣故，尚需更長(zhǎng)時(shí)間AIT進(jìn)一步驗(yàn)證。AIT和青蒿總黃酮聯(lián)合處理肝纖維化小鼠模型能夠有效遏制肝纖維化的進(jìn)程，并促進(jìn)逆轉(zhuǎn)過(guò)程，主要體現(xiàn)在膠原纖維長(zhǎng)度縮短，體積變小。運(yùn)動(dòng)康復(fù)改善肝纖維化進(jìn)程的機(jī)制也可能是通過(guò)抑制局部以及全身性炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用的，局部轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)表明肝臟原位炎癥因子的表達(dá)水平被AIT顯著抑制，但抑制效果顯著低于聯(lián)合組，可能延長(zhǎng)訓(xùn)練時(shí)間會(huì)獲得更好的效果。AIT也能夠顯著抑制全身性炎癥免疫應(yīng)答，血清中促炎因子TNF-α和IL-1β顯著下降，而抗炎癥因子IL-10含量則顯著升高。這也提示AIT在肝纖維化治療中與中藥相結(jié)合也許會(huì)增加臨床效用。

綜上所述，青蒿總黃酮聯(lián)合有氧間歇運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練具有更加明顯拮抗及逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化的作用，進(jìn)而阻止其進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。青蒿總黃酮聯(lián)合AIT可以通過(guò)降低肝臟局部及外周血中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，降低局部炎癥反應(yīng)，減輕肝臟損傷，進(jìn)而發(fā)揮治療肝纖維化的效應(yīng)。