胡 月，劉建華，鮑子磊，王世民，范 斌，賈慶瑞，王雪竹，王思云，冉多良

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

馬皰疹病毒1型(Equine herpesvirus-1，EHV-1)是一種可導(dǎo)致馬屬動(dòng)物多種疾病的重要病原體，具有潛伏期較長(zhǎng)(1～4個(gè)月)，建立終身感染[1]。無(wú)論是原發(fā)性感染還是潛伏期再激活，均可引起不同程度的呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、孕馬流產(chǎn)和新生馬駒死亡[2-3]。在全球馬產(chǎn)業(yè)中造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

EHV-1屬于皰疹病毒目，皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬。該亞科以單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)為典型，還包括馬皰疹病毒2型(Equine herpesvirus-2，EHV-2)、馬皰疹病毒4型(Equine herpesvirus-4，EHV-4)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella zoster virus，VZV)[5]。EHV-1雖在皰疹病毒中遺傳穩(wěn)定性較高，但其基因組內(nèi)仍存在多個(gè)單一核苷酸的變異[6-7]。目前，已經(jīng)有美國(guó)、日本、英國(guó)、澳大利亞的研究者測(cè)得流行毒株全基因組序列，為分子流行病學(xué)調(diào)查提供了依據(jù)[6]，而我國(guó)尚未報(bào)道測(cè)得EHV-1病毒的全基因序列。

本研究對(duì)2015年新疆伊犁地區(qū)馬流產(chǎn)胎兒中分離到的EHV-1 XJ2015株[8]進(jìn)行全基因序列測(cè)定，分析其基因組結(jié)構(gòu)，各基因位置、結(jié)構(gòu)及功能，并參考GenBank中31株EHV-1全基因組序列(表1)，進(jìn)行基因組特征及核苷酸同源性分析。旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)EHV-1的分子特征及基因背景，填補(bǔ)我國(guó)EHV-1全基因組序列測(cè)定及分析的空白，為深入了解我國(guó)流行毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)，為基因缺失疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞 毒株于2015年分離自新疆伊犁地區(qū)，命名為EHV-1 XJ2015，BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 和DM 5000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Viral DNA Kit、Gel Extraction Kit 和Cycle Pure Kit購(gòu)自O(shè)MEGA廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；pEASY-Blunt3 Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒培養(yǎng)與核酸提取 將EHV-1 XJ2015株接種于BHK-21細(xì)胞，待病變率達(dá)到80%時(shí)收獲病毒。按照Viral DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組DNA，測(cè)定基因組的濃度及純度，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)合成、病毒基因組分段克隆及測(cè)序 參照GenBank中登錄的31株EHV-1全基因組序列(表1)，比對(duì)后挑選保守區(qū)域設(shè)計(jì)80對(duì)特異性引物，以XJ2015株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相鄰引物擴(kuò)增區(qū)域保證至少重疊200 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后使用Gel Extraction Kit 和Cycle Pure Kit回收純化，克隆至pEASY-Blunt3 Cloning中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆、篩選后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序結(jié)果拼接及DNA相似性檢索 用DNA Man軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BLAST進(jìn)行序列同源性檢索。

1.2.4 開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)及基因注釋 使用ORF finder對(duì)XJ2015株全基因組核苷酸序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)及全基因組結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)Smart BLAST進(jìn)行基因位置、結(jié)構(gòu)及功能的注釋。

1.2.5 基因組特征及同源性分析 使用DAN Man和MEGA7.0進(jìn)行XJ2015株與GenBank中31株EHV-1基因組特征及核苷酸序列同源性分析。

表1 EHV-1參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 EHV-1 XJ2015株全基因組結(jié)構(gòu)分析

由圖1所示，皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)可以分為5種類(lèi)型，經(jīng)測(cè)序、拼接及分析得出XJ2015株基因組結(jié)構(gòu)屬于D型，分為6部分，即長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(Long unique region，UL)、短獨(dú)特區(qū)(Short unique region，US)、長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)末端/內(nèi)部重復(fù)序列(Terminal repeat /Internal inverted repeat of long unique area，TRL/IRL)、短獨(dú)特區(qū)末端/內(nèi)部重復(fù)序列(Terminal repeat /Internal inverted repeat of short unique region，TRS/IRS)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為T(mén)RL-UL-IRL-IRS-US-TRS?；蚪M全長(zhǎng)150 267 bp，G+C含量為56.7%。TRL長(zhǎng)32 bp(1-32位)、UL長(zhǎng)112 887 bp(33-112 919位)、IRL長(zhǎng)32 bp(112 920-112 951位)、IRS長(zhǎng)12 659 bp(112 952-125 610位)、US長(zhǎng)11 998(125 611-137 608)、TRS長(zhǎng)12 659 bp(137 609-150 267位)，與PRV和VZV的基因組結(jié)構(gòu)相似。

U.獨(dú)特區(qū)；TR.末端重復(fù)序列；IR.內(nèi)部重復(fù)序列；α/α′.E型特有反向重復(fù)序列；A.EHV-2；B.卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒；C.EB病毒；D.EHV-1；E.HSV-1

U.Unique region; TR.Terminal repeat; IR:Internal inverted repeat; α/α′.E-type unique reverse repeat；A.EHV-2; B.KsHV; C.EBV; D.EHV-1; E.HSV-1

圖1皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu)類(lèi)型

Fig.1 Overview of the types of herpesvirus genomes

2.2 EHV-1 XJ2015株基因注釋及功能分析

由圖2可知，XJ2015株全基因組共80個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)，UL區(qū)63個(gè)，US區(qū)9個(gè)，IRL區(qū)4個(gè)，TRS區(qū)4個(gè)。包含76個(gè)基因，其中64、65、66、67號(hào)基因位于TRS/IRS區(qū)中，為雙拷貝基因。各基因功能分析表明，76個(gè)基因分為1個(gè)極早期基因(Immediate early gene，IE)、55個(gè)早期基因(Early gene，E)和20個(gè)晚期基因(Late gene，L)?；?5與64分別編碼2種蛋白，因此，全基因組共編碼78種蛋白，6種調(diào)控蛋白，即IEP(IR1)、EICP0(UL63)、EICP22(IR4)、EICPO27(UL5)、IR2P(IR2)和ETIF(UL12)。30種蛋白參與病毒粒子成熟，其中6種與衣殼相關(guān)(UL22、UL25、UL35、UL42、UL43、UL56)，12種為內(nèi)層囊膜蛋白(UL3、UL8、UL11、UL24、UL45、UL46、UL48、UL55、US9)，12種膜糖蛋白分別是gK(UL6)、gN(UL10)、gC(UL16)、gB(UL33)、gH(UL39)、gM(UL52)、gL(UL62)、gG(US3)、g300(US4)gD(US5)、gI(US6)和gE(US7)。其余42種蛋白主要涉及病毒粒子復(fù)制(表2)。

圖2 全基因組ORF及各基因位置、結(jié)構(gòu)示意圖

表2 EHV-1 XJ2015株基因匯總

Table 2 Total genes of EHV-1 XJ2015 strain

基因Gene起始位點(diǎn)Start locus結(jié)束位點(diǎn)Stop locus方向Direction氨基酸大小Condon基因位置Gene location產(chǎn)物特性FunctionHSV相關(guān)基因HSV related gene 11 1721 780+202UL1MHC-1 downregulationUL5622 4361 819-205UL2MembraneNone32 7153 488+257UL3Tegument/conserved in DIPNone44 1233 521-200UL4Nuclear proteinUL5555 7484 336-470UL5EICP27UL5466 9165 885-343UL6gKUL53710 1756 930-1 081UL7DNA helicase-primaseUL52810 17410 911+245UL8Tegument proteinUL51911 98911 009-326UL9dUTPaseUL501011 95812 260+100UL10gNUL49a1112 42313 337+304UL11VP22 tegumentUL491213 47114 820+449UL12ETIFUL481315 19317 808+871UL13VP13/14 tegumentUL471417 95920 202+747UL14Tegument proteinUL461521 04620 363-227UL15Virus egress/MembraneUL451622 72721 321-468UL16gCUL441724 11022 905-401UL17MembraneUL431825 57224 355-405UL18DNA polvmeraseUL421926 13827 631+497UL19VHSUL412028 73527 770-321UL20RR2UL402131 15228 780-790UL21RR1UL392232 79231 395-465UL22ICP35 capsid assemblyUL382333 16836 230+1 020UL23ICP32UL372436 46446 870+3 468UL24ICP1/2 tegumentUL362547 32846 969-119UL25Small capsid proteinUL352648 24747 420-275UL26MembraneUL342748 87448 386-162UL27DNA packaging proteinUL332848 78050 642+620UL28DNA packaging proteinUL322950 63551 615+326UL29Req.for envelopmentUL313055 20151 539-1 220UL30DNA polymerase catalyticUL303155 47059 099+1 209UL31ICP8 ssDNA-binding proteinUL293259 26061 587+775UL32Cleavage/Packaging proteinUL283361 44964 391+980UL33gBUL273464 59565 077+160UL34V32 proteinNone3567 11065 170-646UL35Capsid maturation proteaseUL2635.566 15965 170-329UL35.5ICP35 capsid assemblyUL26.53668 99267 229-587UL36CapsidUL253769 91469 096-272UL37Nuclear proteinUL243869 92770 985+352UL38Thymidine kinaseUL233971 20973 755+848UL39gHUL224076 24174 649-530UL40Tegument proteinUL214176 81077 529+239UL41Envelope protein/VirionUL204277 72081 850+1 376UL42Capsid protein/VP5UL194382 10083 044+314UL43Capsid triplex subunit 2(VP23)UL184484 52983 165-454UL44DNA packaging proteinNone4584 49786 617+706UL45DNA packaging /tegumentUL174686 63787 749+370UL46Tegument proteinUL164788 93487 831-367UL47DNA packaging proteinUL154888 96489 917+317UL48Tegument proteinUL144989 38691 170+594UL49Tyr kinaseUL135091 15292 849+565UL50Alkaline DNaseUL125192 80193 025+74UL51Virion/envelopmentUL115294 48993 137-450UL52gMUL105394 40797 070+887UL53Origin-binding helicaseUL9

續(xù)表2

基因Gene起始位點(diǎn)Start locus結(jié)束位點(diǎn)Stop locus方向Direction氨基酸大小Condon基因位置Gene location產(chǎn)物特性FunctionHSV相關(guān)基因HSV related gene 5497 08699 341+751UL54DNA helicase-primaseUL855100 34999 438-303UL55Tegument proteinUL756102 408100 147-753UL56Capsid protein/Potal proteinUL657102 392105 037+881UL57DNA helicase-primaseUL558105 087105 764+225UL58Nuclear protein/VirionUL459106 433105 894-179UL59Protein V57None60107 133106 495-212UL60ICP22UL361108 161107 223-312UL61Uracil-DNA glycosylaseUL262108 820108 164-218UL62gLUL163112 002110 404-532UL63EICP0IE 11064118 526114 063-1 487IR1IEPICP4144 612149 075+1 48764.5118 526115 0291 165IR2IR2PNone145 578149 0751 16565121 160122 209+349IR4EICP22US1141 980140 931-34966122 823123 533+236IR5VirionUS10140 317139 607-23667125 155124 337-272IR6Virion/froms filamentsV67137 986138 804+27268126 236124 980-418US1VirionUS269126 372127 520+382US2Serine-threonine protein kinasseUS370127 642128 877+411US3gGUS471129 058131 511+817US4gp300None72131 454132 812+452US5gDUS673132 920134 194+424US6gIUS774134 427136 079+550US7gEUS875136 076136 468+130US8MembraneNone76136 804137 463+219US9Tegument proteinUS9

2.3 EHV-1病毒基因組特征及同源性分析

如表3所示，EHV-1全基因組大小為147 kb～150 kb，G+C含量為56.4%～56.7%。32株病毒基因組核苷酸序列同源性為86.74%。通過(guò)對(duì)各毒株基因組6個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)序列長(zhǎng)度及同源性分析得出，TRL/IRL相對(duì)較保守，均為32 bp，同源性為99.49%；UL約為112.7 kb，同源性為95.91%；US約為12.1 kb，同源性為94.5%；TRS/IRS約12.0 kb，但變異較大，同源性?xún)H為65.99%。

病毒基因組核苷酸同源性分析顯示，XJ2015株與英國(guó)毒株Ab同源性最高，達(dá)到93.58%，基因組G+C含量相同，均為56.7%；與美國(guó)毒株T-616的同源性最低，雖G+C含量相同，但同源性?xún)H為76.72%。由表1可知，T-616是在流產(chǎn)斑馬的胚胎器官中分離到的，T529株是在野驢胎兒中分離得到的，94-137是在瞪羚的腦組織和肺中分離得到的，同源性均低于80%。

3 討論

EHV-1全基因組序列自1991年7月首次發(fā)布以來(lái)[6]，迄今已有33株提交到GenBank中，其中2株為基因缺失株，31株野生毒株。我國(guó)雖于1980年由劉景華等[9]首次分離到該病毒，但未測(cè)定其基因組序列。本研究為我國(guó)首次獲得EHV-1流行毒株基因組序列，并經(jīng)分析表明該毒株與國(guó)外多數(shù)以馬為宿主的EHV-1親緣關(guān)系密切，基因組核苷酸同源性為82.63%～93.58%，但與在斑馬、瞪羚、野驢中的分離毒株的同源性只有76.72%～79.79%。與XJ2015株同源性最高的為英國(guó)毒株Ab4，該株可引起馬嚴(yán)重的臨床疾病，包括高頻率的流產(chǎn)癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并被視為神經(jīng)基因型參考毒株[10-12]。

盡管普遍認(rèn)為EHV-1的宿主范圍受到馬屬動(dòng)物的限制，但已有報(bào)道從非馬屬動(dòng)物如牛、駱駝、鹿、北極熊、羊駝中分離到該病毒，其宿主差異導(dǎo)致核苷酸同源性降低[13-15]。Souichi Y等[3]認(rèn)為EHV-1基因組中的突變使其可在馬屬動(dòng)物和反芻動(dòng)物種間傳播，并通過(guò)全病毒限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析得出是TRS/IRS和US的變異所致。本文通過(guò)對(duì)EHV-1基因組結(jié)構(gòu)特性分析表明各毒株TRS/IRS變異最大，同源性?xún)H為65.99%。

表3 EHV-1基因組結(jié)構(gòu)特性及同源性

注： 基因組、TRL、UL、IRL、IRS、US、TRS單位為bp；G+C含量、同源性單位為%。

Note:Genomes,TRL,UL,IRL,IRS,US,TRSunits:bp; G+C content,Homology units:%.

而根據(jù)Seong K等[16]報(bào)道位于TRS/IRS的基因ORF64編碼的IEP在α皰疹病毒間具有廣泛的同源性。EHV-1 IE部分區(qū)域與HSV-1的 ICP4和VZV ORF62編碼蛋白部分區(qū)域有約60%的氨基酸同源性[17]。Ochir P等[18]通過(guò)長(zhǎng)距離聚合酶鏈反應(yīng)(LA-PCR)和RFLP分析比較EHV-1 P和EHV-1B，發(fā)現(xiàn)限制性位點(diǎn)差異集中在IEP基因下游且被EHV-4的相應(yīng)區(qū)域替換，表明EHV-1B是EHV-1P和EHV-4之間的自然重組病毒。

本研究獲得我國(guó)EHV-1流行株毒株XJ2015全基因組序列，掌握其分子特征、基因功能及親緣關(guān)系，得到78個(gè)編碼蛋白的氨基酸序列。今后將繼續(xù)探索我國(guó)EHV-1流行毒株遺傳衍化規(guī)律，深入分析TRS/IRS同源重組特性及毒力相關(guān)基因特征，為建立反向遺傳操作平臺(tái)及研制基因缺失疫苗提供研究基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。