付明哲，楊 峰，郝玉青，許信剛，張 琪*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.榆林市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西榆林 719000)

小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PRRV)屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，羊、鹿等小型反芻類動物感染PPRV后導(dǎo)致以稽留熱、壞死性胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉為主要臨床癥狀的急性接觸性傳染病小反芻獸疫，我國將該病列為一類動物疫病[1-2]。山羊和綿羊?qū)PRV最為易感，其感染后的發(fā)病率和病死率可高達(dá)100%。我國自2007年暴發(fā)小反芻獸疫，隨后全國23個省、市、自治區(qū)地區(qū)都有該病的報道，近年呈區(qū)域內(nèi)點狀散發(fā)，給我國畜牧業(yè)的發(fā)展造成了困擾[3-5]，因此，一種特異、靈敏、量化且耗時短的檢測PPRV的方法對小反芻獸疫的防控很有必要。目前實驗室檢測PPRV的最常用方法是反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法，然而在靈敏度和病毒含量測定以及檢測速度等方面尚存在一些不足[6]。實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR)憑借其簡單的操作，較高的靈敏度，良好的重復(fù)性和量化的結(jié)果以及較短的檢測時耗等優(yōu)點[7]，逐漸在實驗室的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是費(fèi)用相對較低的熒光染料法實時定量PCR[8-10]。本研究根據(jù)NCBI中登錄的PPRV的N基因設(shè)計特異性引物，建立基于Eva Green的反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測方法，以期為PPRV的臨床檢測提供一種特異、靈敏、量化及快速的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株 小反芻獸疫病毒疫苗購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；羊口瘡疫苗購自山東泰豐生物有限公司；山羊痘疫苗購自山東綠都公司；羊流產(chǎn)嗜性衣原體由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室分離保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自康維世紀(jì)生物科技公司。

1.1.2 待檢病料 16份臨床PPRV cDNA樣品由榆林市動物疫病預(yù)防控制中心提供，主要是2014年陜北榆林地區(qū)由農(nóng)業(yè)部國家外來動物疫病防控制中心確診的養(yǎng)殖場病料樣品提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，全部病羊按照國家相關(guān)要求處理[3,6]，確診為PPRV陰性的脾臟由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.3 主要試劑 DNA Marker DL 2 000和2×TaqMaster Mix購自康維世紀(jì)生物科技公司；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pEAST-T1克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物公司；2×Eva Green Premix購自ABM生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 通過對比分析NCBI中登錄的小反芻獸疫病毒(HQ197753.1)的N基因序列保守序列，用Primer 5設(shè)計一對特異性引物。所設(shè)計的熒光定量特異性上游和下游引物序列分別為PPRV-F：5′-TCCATCATTACCCGTTCA-3′，PPRV-R：5′-TGTCCAAATCAGCACCAC-3′，擴(kuò)增片段長度為244 bp。引物由西安擎科澤西生物公司合成，稀釋至濃度為10 μmol/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PPRV RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取稀釋的疫苗病毒液200 μL，加1 mL Trizol試劑，使用Trizol法提RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA在-20℃存儲或進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.3 常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增 50 μL反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix和模板分別為25 μL、6 μL，上、下游引物均為4 μL，雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30次循環(huán)；72℃ 2 min。

1.2.4 RT-qPCR陽性質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)模板制備 按照膠回收試劑盒回收1.2.3擴(kuò)增的目的片段，并將其按照pEAST-T1克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒菌。重組質(zhì)粒菌經(jīng)常規(guī)PCR鑒定為陽性后，將重組質(zhì)粒菌中的陽性質(zhì)粒按照試劑盒的操作步驟提取，進(jìn)行測序分析。用超微量光譜分析儀測定陽性質(zhì)粒濃度，按照以下公式將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，然后進(jìn)行10-1～10-9的梯度稀釋。稀釋后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，放置-20℃保存?zhèn)溆谩？截悢?shù)(copies/μL)=C×NA/MW，其中C為陽性質(zhì)粒測定的濃度，單位ng/μL，NA取值為6.02×1023copies/mol，MW為平均分子質(zhì)量，單位Dolton。

1.2.5 RT-qPCR擴(kuò)增 10 μL反應(yīng)體系：2×Eva Green Premix、標(biāo)準(zhǔn)模板、上游和下游引物分別為5 μL、1 μL、0.3 μL、0.3 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95℃ 10 min：95℃ 3 s，60℃ 30 s，采集熒光信號，35次循環(huán)。

1.2.6 RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 選取濃度稀釋10-4～10-8的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。結(jié)果以實時熒光定量PCR儀(TL988)自帶軟件分析繪制擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線。

1.2.7 RT-qPCR特異性試驗 用建立的RT-qPCR方法分別檢測PPRV、羊口瘡病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、羊流產(chǎn)嗜性衣原體的cDNA或者DNA，驗證建立的RT-qPCR方法的特異性。

1.2.8 RT-qPCR靈敏性試驗 選取濃度稀釋了10-6～10-10的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，RT-qPCR方法擴(kuò)增。選取濃度稀釋了10-6～10-9的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，雙蒸水為陰性對照模板，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增。通過比較兩種方法可以檢測到陽性結(jié)果的最低濃度，以此得出靈敏程度。

1.2.9 RT-qPCR重復(fù)性試驗 分別以同一批次104～106copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板和不同批次104～106copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，用雙蒸水作為陰性對照模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.10 臨床樣品的檢測 取16份臨床PPRV RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品做待測樣本，以標(biāo)準(zhǔn)模板做陽性對照模板，以雙蒸水為陰性對照模板，用所建立的RT-qPCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)粒PCR鑒定

將菌液用熒光定量特異性引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果為244 bp目的片段(圖1)。將鑒定為陽性的質(zhì)粒測序，通過Blast比對，結(jié)果同源性達(dá)100%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA Maker DL 2 000; 1.PCR products of positive plasmid; 2.Negative control

圖1陽性質(zhì)粒PCR鑒定

Fig.1 PCR identification of positive plasmid

2.2 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)模板的制備

用超微量光譜分析儀測定提取質(zhì)粒的濃度為112.5 ng/μL，OD260/OD280值為1.827，計算得拷貝數(shù)為2.46×1010copies/μL，將其稀釋至濃度分別為2.46×109copies/μL、2.46×108copies/μL、2.46×107copies/μL、2.46×106copies/μL、2.46×105copies/μL、2.46×104copies/μL、2.46×103copies/μL、2.46×102copies/μL、2.46×101copies/μL、2.46×100copies/μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

建立標(biāo)準(zhǔn)模板的RT-qPCR擴(kuò)增曲線見圖2。相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。其熔解曲線見圖4。在2.46×102copies/μL～2.46×107copies/μL的濃度區(qū)間內(nèi)，所得拷貝數(shù)(x)與Ct值(y)的線性方程為y=-3.39x+37.637，斜率為-3.39，截距為37.637，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999，顯示了良好的線性關(guān)系。熔解曲線峰型單一，無雜峰，熔解溫度一致，Tm=84.9℃。

1～6.2.46×107copies/μL～2.466×102copies/μL 6個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的qRT-PCR擴(kuò)增曲線；NC.陰性對照

1-6.qRT-PCR amplification curves of 2.46×107copies/μL to 2.46×102copies/μL diluted standard template,respectively; NC.Negative control

圖2實時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Fig.2 The amplification curve of RT-qPCR

圖3 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 實時熒光定量PCR熔解曲線

2.4 RT-qPCR特異性試驗

分別以PPRV、ORFV、GTPV和羊流產(chǎn)嗜性衣原體以及確診PPRV陰性的脾臟cDNA或者DNA為模板，用建立的RT-qPCR方法擴(kuò)增，結(jié)果只有PPRV有熒光信號(圖5)，說明所建立的RT-qPCR方法特異性好。

圖5 RT-qPCR特異性試驗擴(kuò)增曲線

2.5 RT-qPCR靈敏性試驗

以2.46×104copies/μL～2.46×100copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為模板，進(jìn)行RT-qPCR方法擴(kuò)增。以2.46×105copies/μL～2.46×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板作為模板，用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增。結(jié)果表明，RT-qPCR方法檢出限為2.46×101copies/μL(圖6)，常規(guī)PCR方法檢出限為2.46×103copies/μL(圖7)，說明建立的RT-qPCR檢測方法與常規(guī)RT-PCR相比靈敏100倍。

1～5.2.46×104copies/μL～2.46×100copies/μL 5個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的RT-qPCR擴(kuò)增曲線；NC.陰性對照

1-5.RT-qPCR amplification curves of 2.466×104copies/μL to 2.466×100copies/μL diluted standard template,respectively; NC.Negative control

圖6 RT-qPCR靈敏性試驗

Fig.6 Sensitivity test of RT-qPCR

2.6 RT-qPCR重復(fù)性試驗

以2.46×106copies/μL、2.46×105copies/μL、2.46×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板為反應(yīng)模板，每個模板做3個重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(表1)，每隔1周做1次，每次做3個重復(fù)，計算平均值，做3次，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(表2)。結(jié)果顯示，建立的RT-qPCR方法的變異系數(shù)在1%以下，其重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異。

2.7 方法的初步應(yīng)用

應(yīng)用本試驗所建立的RT-qPCR檢測方法對16份臨床病料提取RNA并反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品進(jìn)行檢測，并與RT-PCR作對比。檢測結(jié)果顯示， RT-PCR法檢測到陽性樣品16份，RT-qPCR方法檢測到陽性樣品也為16份，RT-qPCR方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.2.46×105copies/μL～2.46×101copies/μL 4個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)模板的常規(guī)PCR產(chǎn)物；NC.陰性對照

M.DNA Maker DL 2 000; 1-4.The PCR products of 2.46×105copies/μL to 2.46×101copies/μL diluted standard template; NC.Negative control

圖7 常規(guī)PCR靈敏性試驗

表2 RT-qPCR組間重復(fù)試驗

3 討論

我國小反芻獸疫盡管在2015年后已得到控制，但仍呈地方散發(fā)，通過實驗室檢測手段對早期感染和隱性帶毒者高效、快速的檢出，可以為小反芻獸疫防控與凈化提供一定的幫助。目前實驗室診斷PPRV的方法主要有病毒的分離鑒定、中和試驗、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗、ELISA、免疫熒光抗體試驗、RT-PCR等方法[11]，這些檢測方法在病原檢測方面都存在一定的缺點，如病原分離耗時長，中和試驗特異性低，瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗、ELISA等方法尚無法鑒別牛瘟病毒和小反芻獸疫病毒。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用熒光標(biāo)記方法檢測特異性產(chǎn)物的實時熒光定量PCR技術(shù)，因其靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、耗時短、過程封閉、操作簡單、成本相對較低等眾多優(yōu)點，逐漸在病原體檢測、目的基因表達(dá)量、疫苗質(zhì)量控制等方面得到廣泛的使用。

在實時熒光定量PCR試驗過程中，要注意做好防污染工作，盡管試驗操作比較簡單，但操作中的污染如氣溶膠的污染會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；在制作標(biāo)準(zhǔn)模板時，要使陽性質(zhì)粒完全混合均勻，以此保證標(biāo)準(zhǔn)模板的濃度梯度正確性。由于熒光染料能夠被嵌入到任何脫氧核糖核酸的雙鏈間，所以RT-qPCR熒光染料法的引物在設(shè)計時要認(rèn)真考慮長度、退火溫度、保守性、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等方面的問題，尤其是其中的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)問題，其關(guān)系到定量的準(zhǔn)確性。以上方面考慮的越周全，得到的結(jié)果越穩(wěn)定，越可靠[12]。Eva Green作為飽和熒光染料，沒有“染料重排”的缺點，熔解曲線的分辨率相對較高，而且可以在擴(kuò)增過程當(dāng)中及時的從DNA雙鏈中釋放出來，從而降低了對PCR擴(kuò)增過程的影響，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料準(zhǔn)確性高。故此，本研究選取Eva Green作為RT-qPCR的熒光染料。

本研究根據(jù)NCBI上登錄的PPRV的N基因，設(shè)計了一對擴(kuò)增的目的片段為244 bp的特異性引物，構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板，使用Eva Green作為信號報告熒光，建立PPRV RT-qPCR的檢測方法。結(jié)果表明，該檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，熔解曲線峰型單一；特異性強(qiáng)，只能檢測出PPRV，最低檢測拷貝數(shù)為2.46×101copies/μL；重復(fù)試驗變異系數(shù)在1%之下，重復(fù)性良好；用建立的RT-qPCR方法檢測16份PPRV的陽性樣本，結(jié)果均為陽性；整個RT-qPCR擴(kuò)增過程只需45 min，時間過程短。綜上所述，本研究建立的PPRV RT-qPCR檢測方法，具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，而且耗時短，可用于臨床檢測小反芻獸疫病毒感染，對小反芻獸疫的防控提供一定的技術(shù)支持。