華思紅，熊貝佳，樊鈺瑩，孫永科，楊玉艾

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、熱性、致死性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失[1]。E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性中和抗體，保護(hù)豬抵抗致死量CSFV的攻擊，在新型疫苗的研發(fā)上發(fā)揮著重要作用[2]。以CSFV E2基因?yàn)榘谢虻幕蚬こ桃呙绲难芯咳〉昧肆己玫倪M(jìn)展，如Sun Yuan等用CSFV E2基因構(gòu)建的腺病毒/甲病毒復(fù)制子嵌合載體豬瘟疫苗rAdV-CSFV-E2免疫試驗(yàn)兔和豬，均可產(chǎn)生較高的CSFV特異性中和抗體，提供完全保護(hù)[3]。Wu Chi-ming等將E2基因與桿狀病毒重組，并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的E2可以保護(hù)接種豬免受強(qiáng)毒的攻擊[4]。郭抗抗等用豬瘟病毒Shimen株E2基因構(gòu)建的“自殺性” DNA疫苗重組質(zhì)粒pSCA1-E2免疫小鼠后能產(chǎn)生較高水平的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)，免疫豬可檢測到抗CSFV特異性血清抗體[5]。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，感染PRRSV可引起大批妊娠母豬流產(chǎn)和仔豬的高死亡率，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白分別為GP2、GP3、GP4、GP5、M蛋白以及N蛋白，分別由病毒基因組ORF2～7編碼[7]。GP5蛋白由ORF5基因編碼，是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在病毒的吸附和穿入、生物合成與組裝和誘發(fā)T細(xì)胞的增殖應(yīng)答過程中都發(fā)揮著重要作用，對于研制重組亞單位疫苗及核酸疫苗有重要意義[8]。曹亮等通過重組病毒分別表達(dá)GP3、GP5及共表達(dá)GP3-GP5蛋白，免疫小鼠后顯示出良好的免疫原性[9]。許信剛等用PRRSV主要保護(hù)性抗原基因ORF5構(gòu)建的重組疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)免疫小鼠和豬體后，能夠誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)[10]。

本研究將CSFV E2和PRRSV GP5基因串聯(lián)，克隆到腺病毒穿梭載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)染獲得了表達(dá)E2和GP5蛋白的重組腺病毒rAd-E2-GP5。通過豬體免疫保護(hù)試驗(yàn)，從臨床癥狀、抗體水平、免疫攻毒保護(hù)水平及病理學(xué)變化等方面綜合評價(jià)rAd-E2-GP5的免疫保護(hù)效果，以期為CSFV和PRRSV聯(lián)合疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 表達(dá)CSFV E2和PRRSV GP5基因重組腺病毒rAd-E2-GP5為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；PRRSV減毒活疫苗(TJM-F92株，瑞蘭安)購自碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司(批號：1504004，1504019)，有效期1年；豬瘟兔化弱毒疫苗(豬瘟脾淋苗)由青島易邦生物工程有限公司惠贈(批號：201607，201608)，有效期1年。

1.1.2 毒株 攻毒用豬瘟病毒強(qiáng)毒為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存血毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒強(qiáng)毒由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防實(shí)驗(yàn)室尹格芬老師惠贈。

1.1.3 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker(DL1000、DL2000)均購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)購自羅氏公司；瓊脂糖購自Biotopped公司；Trizol、氯仿、異丙醇、無水乙醇、丙烯酰胺(SDS)購自西隴化工股份有限公司。

1.1.4 試劑盒 豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒和豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.1.5 試驗(yàn)用動物 35頭34日齡～38日齡的健康斷奶仔豬，購自云南玉溪某豬場，該豬場近2年未出現(xiàn)PRRS和CSF疫情，所挑選試驗(yàn)豬未經(jīng)PRRS和CSF疫苗免疫，試驗(yàn)前采集血樣進(jìn)行PRRSV和CSFV ELISA抗體及RT-PCR抗原檢測，均為陰性。試驗(yàn)地點(diǎn)為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物房。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將35頭未免疫陰性豬隨機(jī)分為7組(表1)，每組5頭，1、2、3組每頭接種2 mL劑量為1×108TCID50的rAd-E2-GP5，4、5、6組接種PRRS、CSF、PRRS+CSF商品苗，使用按說明書進(jìn)行，7組接種DMEM，所有組試驗(yàn)豬免疫途徑均為頸部肌肉注射，均在一免后21 d以相同的途徑和劑量再次免疫，二免后21 d攻毒，1、4組和7組中2頭攻3×105.5TCID50PRRSV強(qiáng)毒，攻毒方式為每頭鼻滴2 mL，肌肉注射1 mL；2、5組和7組中2頭攻4×103TCID50CSFV強(qiáng)毒，攻毒方式為每頭鼻滴2 mL，肌肉注射2 mL；3、6組和7組中1頭攻3×105.5TCID50PRRSV+4×103TCID50CSFV強(qiáng)毒。

1.2.2 體溫檢測及臨床觀察 攻毒后每天早上用溫度計(jì)測量所有豬直腸溫度，繪制體溫曲線；每日觀察各組豬的精神、采食、飲水、糞便和發(fā)病情況，記錄臨床癥狀。

1.2.3 體重測量 免疫接種后每周測量體重，觀察各組之間體重增長情況。

1.2.4 豬血清抗體的檢測 在一免第0、7、14、21天、二免后第7、14、21天及攻毒后第7、14天于豬前腔靜脈采集每頭豬血液，按常規(guī)方法無菌分離血清，采用科前的CSFV抗體ELISA檢測試劑盒和PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒分別檢測CSFV和PRRSV抗體，具體操作和結(jié)果判定按試劑盒說明書進(jìn)行。豬繁殖與呼吸綜合征KQ≥20判為陽性，KQ<20判為陰性；豬瘟阻斷率≤30%判為陰性，≥40%判為陽性，在30%～40%判為可疑。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)和組織中病毒核酸檢測 根據(jù)CSFV E2基因和PRRSV GP5基因的序列，使用分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物。CSFV上游引物為：5′-GAATCTGGTGGGTCCCTC-3′，CSFV下游引物為：5′-GTTACCCTCACCTCCTTGG-3′，擴(kuò)增長度294bp；PRRSV上游引物為：5′-CCATTCTGTTGGCAATTTGA-3′，PRRSV下游引物為：5′-GGCATATATCATCACTGGCG-3′，擴(kuò)增長度716 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用濃度為50 μmol/L。

無菌采集試驗(yàn)過程中病死豬以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死豬的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟、肝臟、心臟于自封袋中，用生理鹽水配300 mL/L甘油浸泡保存，用Gibico公司的Trizol Reagent試劑提取其總RNA，用以上引物進(jìn)行RT-PCR檢測組織中CSFV和PRRSV的有無情況。

1.2.6 剖檢記錄 對試驗(yàn)致死豬剖檢并記錄病理變化，攻毒后15 d處死所有存活試驗(yàn)豬，剖檢并記錄。

1.2.7 攻毒保護(hù)率 攻毒后主要從有無豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征臨床癥狀、體溫反應(yīng)、剖檢病理變化、存活率等方面進(jìn)行評價(jià)，統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

1組(rAd-E2-GP5 1組)和3組(rAd-E2-GP5 3組)攻毒后均有4頭臨床發(fā)病，攻毒后第2天體溫升高至41℃以上，精神沉郁，食欲減退甚至廢絕，被毛無光澤，消瘦，全身發(fā)紅，出現(xiàn)結(jié)膜炎，全身發(fā)紅，氣喘，部分豬有咳嗽、耳尖發(fā)紺、后肢站立不穩(wěn)，在攻毒后第11～14天開始體溫下降。每組均有1頭精神狀態(tài)良好，無臨床表現(xiàn)。

2組(rAd-E2-GP5 2組)和5組(豬瘟脾淋苗組)整體試驗(yàn)豬精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)異常。

4組(PRRSV減毒活疫苗免疫組)和6組(PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組)攻毒后均有1頭臨床發(fā)病，攻毒后第3天體溫升高，超過41℃，精神沉郁，食欲減退，持續(xù)6 d～10 d后體溫逐漸下降，后期呼吸困難、體表發(fā)紅、精神萎靡。每組中的另外4頭精神狀態(tài)良好，無臨床表現(xiàn)。

7組(空白對照組)高熱稽留，出現(xiàn)典型的CSF和PRRS癥狀，攻毒后6 d～8 d全部死亡。

2.2 體溫檢測結(jié)果

攻毒后，商品苗對照組和重組腺病毒豬瘟攻毒組體溫均在正常范圍內(nèi)，無顯著差異(P>0.05)；重組腺病毒豬藍(lán)耳病攻毒組和同時(shí)攻豬瘟、豬藍(lán)耳病組與商品苗對照組在攻毒后1 d體溫升高至40℃以上，稽留不下，于攻毒后13 d降至正常值，但明顯好于空白對照組，直腸溫度變化見圖1。

2.3 體重變化

免疫期間所有試驗(yàn)豬體重均成穩(wěn)定上升趨勢，無顯著差異(P>0.05)，攻毒后，重組腺病毒組單獨(dú)攻CSFV組和脾淋苗對照組仍穩(wěn)定上升，PRRSV減毒活疫苗組、PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組無差異，重組腺病毒PRRSV攻毒組、CSFV+PRRSV攻毒組和空白對照組體重下降(圖2)。

圖2 體重變化曲線

2.4 疫苗免疫和攻毒后豬抗體水平變化

從圖3和圖4可看出，商品苗對照組PRRSV特異性抗體在二免后21 d快速上升，攻毒后KQ值高達(dá)101.74；而重組腺病毒組在免疫期間PRRSV特異性抗體值為陰性，攻毒后稍有上升。重組腺病毒組一免后14 d、商品苗對照組一免后21 d，CSFV特異性抗體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢；而空白對照組均未檢出抗PRRSV特異性抗體和抗CSFV特異性抗體。提示rAd-E2-GP5具有激發(fā)免疫豬產(chǎn)生針對CSFV的特異性抗體的作用，但不具有激發(fā)免疫豬產(chǎn)生針對PRRSV的特異性抗體的作用。

2.5 攻毒后組織PRRSV和CSFV核酸檢測

結(jié)果表明，重組腺病毒組和商品苗對照組各組織中均未檢測到CSFV，空白對照組攻CSFV的所有試驗(yàn)豬中檢測到了CSFV。重組腺病毒組PRRSV、CSFV+PRRSV攻毒組4/5檢測出PRRSV，PRRSV減毒活疫苗組和豬瘟脾淋苗+PRRSV減毒活疫苗免疫攻毒組1/5檢測出PRRSV，空白對照組攻PRRSV的所有試驗(yàn)豬中檢測到了PRRSV(表2、表3)。

圖3 ELISA檢測PRRSV抗體水平

圖4 ELISA檢測CSFV抗體水平

組別Groups組號№臟器名稱 Organ name心臟Heart肝臟Liver脾臟Spleen肺臟Lung腎臟Kidney頜下淋巴Submandibular lymph腹股溝淋巴Inguinallymph重組腺病毒組 Recombinant adenovirus group10/50/50/50/50/50/50/520/50/50/50/50/50/50/530/50/50/50/50/50/50/5商品苗對照組 Commercial vaccine group40/50/50/50/50/50/50/550/50/50/50/50/50/50/560/50/50/50/50/50/50/5DMEM73/53/53/53/53/53/53/5

表3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒在各器官中RT-PCR的檢測結(jié)果

2.6 病理剖檢結(jié)果

1組(rAd-E2-GP5 1組)和3組(rAd-E2-GP5 3組)攻毒后5頭均出現(xiàn)眼觀病變：脾臟腫大，呈暗紫色，有出血點(diǎn)，邊緣有梗死；腎臟有大小不一彌散性出血點(diǎn)，剖開腎乳頭和腎盂有明顯出血點(diǎn)；肺臟腫大，有淤血，呈肉變；淋巴結(jié)腫大；膀胱和胃有出血點(diǎn)。2組(rAd-E2-GP5 2組)2頭、5組(豬瘟脾淋苗免疫組)3頭，淋巴結(jié)腫大，膀胱、胃和脾臟邊緣有出血點(diǎn)。其余未見異常。4組(PRRSV減毒活疫苗免疫組)3頭、6組(PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組)4頭有眼觀病變，淋巴結(jié)腫大有出血點(diǎn)；腎臟有出血點(diǎn)；肺臟腫大，有出血點(diǎn)，有輕微炎性變化，少數(shù)有斑塊狀實(shí)變區(qū)。其余未見異常。7組(空白對照組)所有試驗(yàn)豬表現(xiàn)出典型的PRRS和CSF病理變化。

2.7 疫苗保護(hù)率

空白對照組在攻毒后6 d～8 d全部死亡，期間體溫高熱稽留，表現(xiàn)典型的PRRS和CFS癥狀，剖檢組織病變嚴(yán)重；重組腺病毒組CSFV攻毒組和豬瘟脾淋苗對照組臨床上均得到5/5保護(hù)，剖檢分別2/5頭、3/5頭有眼觀病變；重組腺病毒組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組臨床上1/5保護(hù)，剖檢5/5頭有眼觀病變；商品苗對照組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組臨床上4/5保護(hù)，剖檢分別4/5頭、3/5頭有眼觀病變(表4)。

3 討論

豬瘟和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病率和病死率都非常高，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的兩大主要烈性傳染病，均給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫是控制這兩種疫病的主要措施[11]。好的疫苗可以降低疫病的發(fā)生和疫病風(fēng)險(xiǎn)，保證養(yǎng)豬業(yè)正常健康的發(fā)展。但PRRSV和CSFV的免疫抑制性，多次抓豬引起的應(yīng)激反應(yīng)等原因都會影響疫苗的免疫效果，導(dǎo)致免疫失敗[12]。聯(lián)苗的使用在動物疫病防控中越來越受到人們的重視。碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司研發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯(lián)活疫苗(TJM-F92株+C株)2016年在中國上市，實(shí)驗(yàn)室報(bào)告結(jié)合臨床試驗(yàn)表明該疫苗安全性和保護(hù)性都較好[13]。

表4 攻毒保護(hù)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

高飛等基于高致病性PRRSV細(xì)胞致弱株HuN4-F112的反向遺傳操作平臺，將CSFV強(qiáng)毒株的E2基因插入PRRSV基因組ORF1b和ORF2之間，構(gòu)建的重組病毒rPRRSV-E2免疫仔豬后無臨床表現(xiàn)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對PRRSV的抗體和高水平的CSFV的中和抗體[14]。研究表明，聯(lián)苗的使用可以突破臨床上兩種病毒疫苗同時(shí)使用所造成的相互影響，減少免疫次數(shù)，達(dá)到“一針防兩病”的效果。

本研究結(jié)合前人研究的載體基礎(chǔ)[15]，將CSFV和PRRSV的主要保護(hù)性基因串聯(lián)，構(gòu)建了重組腺病毒rAd-E2-GP5。本試驗(yàn)的豬體免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組腺病毒組CSFV攻毒組和脾淋苗對照組攻毒后體重穩(wěn)定上升，體溫正常，無臨床表現(xiàn)，剖檢后組織中未檢測到CSFV核酸，說明rAd-E2-GP5在豬免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中起到保護(hù)作用(5/5)。重組腺病毒組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組攻毒后出現(xiàn)高熱(4/5)，對應(yīng)豬表現(xiàn)臨床癥狀(4/5)，用RT-PCR檢測到對應(yīng)豬PRRSV陽性(4/5)，說明rAd-E2-GP5在豬免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中起到一定的保護(hù)作用(1/5)。ELISA檢測抗體水平，重組腺病毒組在免疫期間PRRSV抗體值為陰性，在攻毒后才上升，與商品苗對照組有明顯差異(P<0.05)，CSFV抗體一免后14 d開始穩(wěn)定上升，與脾淋苗對照組無顯著差異(P>0.05)，說明重組腺病毒免疫豬體后能高效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CSFV特異性體液免疫應(yīng)答，但不能有效誘導(dǎo)PRRSV特異性體液免疫應(yīng)答。在剖檢中發(fā)現(xiàn)部分未表現(xiàn)臨床癥狀的豬只內(nèi)臟器官也出現(xiàn)了輕微眼觀病變，這可能是攻毒劑量太大和攻毒力太強(qiáng)導(dǎo)致的。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，rAd-E2-GP5能保護(hù)致死量的CSFV、PRRSV、CSFV+PRRSV強(qiáng)毒的攻擊，但大部分豬有臨床癥狀和病理變化，在后續(xù)研究中，還需進(jìn)一步加強(qiáng)重組疫苗對PRRS保護(hù)效果的研究，以期能研制出更好的CSFV、PRRSV重組二聯(lián)苗。