吳 萌， 朱善元， 吳海濤， 張繼玲， 王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300)

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(muscovy duck parvovirus，簡稱MDPV)引起的雛番鴨的一種急性、敗血性傳染病[1]，主要感染3周齡以內(nèi)的雛番鴨，俗稱三周病[2-3]。該病作為一種病毒病，重在預防，目前疫苗接種是最主要的預防方式。我國多在雛番鴨1日齡時進行MDPV弱毒苗免疫，但由于母源抗體的影響，以致弱毒苗不能對番鴨完全保護，國內(nèi)外常有該病的報道[4]。因此，研究更為有效安全的MDPV疫苗是目前迫切的任務。

桿狀病毒載體表達系統(tǒng)(baculovirus expression vector system，簡稱BEVS)是一個以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細胞為受體的真核表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)具有安全性高、對外源基因容量大、較好地轉(zhuǎn)錄后加工修飾等優(yōu)點[5]。在桿狀病毒表達系統(tǒng)這些優(yōu)點的基礎上，眾多學者對該系統(tǒng)進一步進行研究改進，最為重要的是Bac-to-Bac系統(tǒng)的構建[6]，使桿狀病毒表達系統(tǒng)能更好地適應基礎研究和應用開發(fā)的需要。

本研究旨在Bac-to-Bac系統(tǒng)中成功表達番鴨細小病毒的VP3基因，為制備VLPs提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與血清 MDPV尿囊液、MDPV抗鼠多抗、PFastBac1載體、大腸桿菌DH5α、DH10Bac感受態(tài)細胞由筆者所在實驗室提供。

1.1.2 酶類和主要試劑pfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自加拿大Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；FITC標記的羊抗鼠二抗購自SouthernBiotech公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 參考GenBank中已發(fā)表的MDPVVP3的基因序列(登錄號：AY510603.1)，設計1對用于擴增VP3基因的引物，引物由英濰捷基(上海)生物技術有限公司合成。引物序列為VP3-FB-F：5′-TATGGATCCATG GCAGAGGGAGGAAGC-3′；VP3-FB-R：5′-TAAGAGCT CCAGATTCTGAGTCAAATACC-3′。序列下劃線處分別為上下游引物插入的NotⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2.2VP3基因的擴增 將MDPV尿囊液煮沸5 min，-20 ℃ 冷凍10 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清為模板，VP3-FB-F、VP3-FB-R為上下游引物擴增VP3基因。反應體系：模板2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)5 μL、10×PCR緩沖液5 μL、上下游引物(25 mmol/L)各2 μL、pfuDNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，加雙蒸水至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構建與鑒定 按膠回收試劑盒的說明書回收目的基因，經(jīng)NotⅠ和BamHⅠ酶切后與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取可疑單菌落培養(yǎng)，PCR初步鑒定，將鑒定正確的菌落提取質(zhì)粒，并以NotⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的菌株送至英濰捷基(上海)生物技術有限公司測序，測序正確的命名為轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。

1.2.4 重組Bacmid DNA的獲得與鑒定 將PFastBac1-VP3重組轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素、100 μg/mL X-gal及40 μg/mL異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)藍白斑現(xiàn)象。將疑似的白色單菌落接種到含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素及10 μg/mL四環(huán)素的10 mL抗性LB試管中，37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，提取重組Bacmid DNA。

以M13上下游引物對重組Bacmid DNA進行鑒定，反應體系為重組Bacmid DNA 2.0 μL，上下游引物(25 mmol/L)各 1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA 酶(5 U/μL)0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應條件：93 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 重組桿狀病毒的獲得與擴增 將重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長的昆蟲細胞Sf9，27 ℃培養(yǎng)，待Sf9細胞出現(xiàn)明顯的病變(細胞核變大，細胞變大變圓，從瓶壁脫落)，收集上清即為P1代重組病毒。P1代重組桿狀病毒滴度一般比較低，須要用P1代病毒繼續(xù)傳代提高滴度。將P1代病毒感染Sf9細胞，48 h后收集細胞上清，即P2代重組桿狀病毒。以P2代病毒感染細胞，得到P3代重組桿狀病毒。

1.2.6 重組蛋白的鑒定

1.2.6.1 SDS-PAGE和Western-blot試驗 將P3代病毒感染Sf9細胞，正常Sf9細胞作為空白對照，待被感染細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細胞沉淀。用適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸沉淀，與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，進行 SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色、脫色，分析結果。

SDS-PAGE結束后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉 4 ℃ 封閉過夜，加入1 ∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌5遍。加入1 ∶3 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1.5 h，PBS洗滌5遍，而二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.6.2 間接免疫熒光試驗 將P3代病毒感染Sf9細胞，以正常Sf9細胞作為空白對照，48 h后，棄培養(yǎng)基上清，PBS洗滌。以預冷的甲醇固定10 min，PBS洗滌后，加入1 ∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育1 h。加入1 ∶500稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 VP3基因的克隆

以處理的MDPV尿囊液為模板進行PCR擴增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結果出現(xiàn)1條約1 602 bp大小的特異性條帶(圖1)，與預期結果相符。

2.2 轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構建與酶切鑒定

將PCR擴增的VP3基因經(jīng)瓊脂糖凝膠分離后，切膠回收，用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1質(zhì)粒連接，獲得轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切得到約1.6 kb和4.7 kb的2條條帶(圖2)，與預期結果相符，且DNA測序結果證明VP3基因克隆正確。

2.3 重組Bacmid DNA的PCR鑒定

以M13上下游引物對重組Bacmid DNA進行PCR鑒定。由圖3可知，重組質(zhì)粒以M13為上下游引物時，出現(xiàn)大小約3.9 kb(2.3 kb+1.6 kb)的條帶；以VP3-PFB-F、VP3-PFB-R為上下游引物時，出現(xiàn)大小約 1.6 kb 的條帶，與預期結果相符。

2.4 重組蛋白的鑒定

2.4.1 SDS-PAGE分析 以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細胞，進行SDS-PAGE。染色脫色后，觀察結果。由圖4可知，被感染的Sf9細胞在約58 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，空白對照沒有。

2.4.2 Western-blot檢測 對重組蛋白進行Western-blot檢測。由圖5可知，重組蛋白在約58 ku處出現(xiàn)特異性條帶，與預期結果相符。表明在Sf9細胞中表達的重組蛋白能與MDPV多抗發(fā)生特異性反應。

2.4.3 間接免疫熒光試驗 以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時，以甲醇固定進行間接免疫熒光試驗。由圖6可知，P3代病毒感染的細胞出現(xiàn)較強的綠色熒光，而正常細胞中未見熒光。

3 討論

番鴨細小病毒最早被報道是在1991年，林世堂等認為是類似小鵝瘟的番鴨病毒病的一種新病毒[1]，隨后程由銓等分離到2株病毒，最后確定本病的病原是細小病毒科的一個新成員[7]。番鴨細小病毒的基因組為單鏈線性DNA，全長 5 136 bp，包含2個主要的開放閱讀框(ORF)。左側ORF編碼非結構蛋白(NS)；右側ORF編碼病毒的3種結構蛋白(VP1、VP2、VP3)。其中VP3是主要的衣殼蛋白，約占總蛋白的80%，能刺激機體產(chǎn)生抗體[8-9]，是誘導機體產(chǎn)生保護性抗體的主要抗原[10]。

桿狀病毒基因組較大，不易通過常規(guī)的酶切連接將外源片段插入其中，通常是將外源片段連接到轉(zhuǎn)移載體上[11]，然后轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒重組，獲得重組桿狀病毒。最初重組桿狀病毒構建時應用的是野生型病毒，該方法重組效率僅 0.1%～1.0%[12]，費事費力，因此在應用上有一定的難度。隨著桿狀病毒載體和篩選方法的不斷改進，1993年 Bac-to-Bac技術問世。Bac-to-Bac技術是根據(jù)F因子載體原理，構建一種桿狀病毒穿梭載體[13]，該載體既可像普通質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中復制，又能感染昆蟲細胞。該方法可使桿狀病毒的最大重組率高達100%，并且操作簡單，提高了工作效率。

本試驗選擇MDPV主要衣殼蛋白基因VP3，將其克隆至pFastBac1載體上，構建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3；轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，藍白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組Bacmid DNA。將重組Bacmid DNA感染昆蟲細胞，制備重組桿狀病毒rBac-VP3，并通過SDS-PAGE分析、Western-blot、間接免疫熒光試驗檢測重組蛋白的表達。結果證明，VP3基因能在桿狀病毒系統(tǒng)中正確表達，為病毒樣顆粒在昆蟲細胞中的自主裝配提供了有力條件和基礎。