， ， ， ，

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心， 寧夏 銀川 750002；2.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 寧夏 銀川750021；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 枸杞工程技術(shù)研究所， 寧夏 銀川 750002)

DNA是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象之一，在植物分子生物學(xué)和遺傳育種中，基因組DNA的質(zhì)量好壞是影響其成敗的關(guān)鍵因素。人們經(jīng)常需要提取高質(zhì)量的植物DNA，用于構(gòu)建基因文庫(kù)、基因組Sourthern 分析、酶切、克隆和測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)植物的研究對(duì)象、研究目的和研究成本等不同，提取基因組DNA 所應(yīng)用的方法也不同。其中，隨著作物分子輔助育種的廣泛應(yīng)用與推廣，基因型鑒定是最主要的工作，基因組DNA的提取則是最繁重、最耗時(shí)的工作之一。目前提取基因組DNA的方法有： 1) CTAB提取法。此方法多用于禾本科植物基因組DNA的提取，是1987年Doyle最先應(yīng)用[1],后來(lái)應(yīng)用改進(jìn)的CTAB法，用特定吸附作用的螯合樹(shù)脂在特定條件下，吸附、純化DNA； 2) PVP提取法。此方法主要應(yīng)用于林木類(lèi)植物DNA的提取，1997年Kim 最先應(yīng)用此方法提取果樹(shù)和針葉類(lèi)林木中高質(zhì)量的DNA[2]； 3) SDS提取法。此方法適用于多種植物DNA的提取。 4) 尿素提取法。此方法適用于一般植物和真核微生物DNA的提取，1990年Dudler最先應(yīng)用此方法[3-5]。這些方法均用到離心機(jī)、提取步驟繁雜、配制化學(xué)試劑種類(lèi)眾多、提取過(guò)程刺激味大，缺乏高效的、快速、環(huán)保的提取植物基因DNA的方法。

本研究針對(duì)以上基因組DNA提取方法存在的不足進(jìn)行改進(jìn)，用時(shí)大約90 s即可完成植物葉片基因組DNA的提取，且完全可以滿(mǎn)足PCR反應(yīng)的基因型鑒定[6]、基因克隆和測(cè)序等需要。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取4 mg水稻新鮮、幼嫩葉片為試驗(yàn)材料。

1.2 主要試劑

植物細(xì)胞裂解液(裂解液中SDS質(zhì)量百分比濃度為0.06%、 EDTA的濃度為25 mmol/L、NaCl的濃度為250 mmol/L、Tris-base 200 mmol/L， pH=8.0)；DNA漂洗液(Tris-base的濃度為10 mmol/L、Tween-20質(zhì)量百分比濃度為0.15%)；2×Mixture PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京擎天生物科技有限公司；DNA Marker DL 2000，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DH 5 α感受態(tài)均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Peasy-T載體為北京全式金生物公司產(chǎn)品，其它試劑為分析純；測(cè)序工作由北京擎天生物科技有限公司用ABI 3730測(cè)序儀完成。

1.3 引物序列與合成

針對(duì)水稻Actin基因設(shè)計(jì)上下游引物Actin_FPrimer，Actin_RPrimer，預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小為459 bp。針對(duì)水稻BADH2第三外顯子片段，擴(kuò)增片段預(yù)計(jì)大小為431 bp。

Actin_FPrimer：TGCTATGTACGTCGCCATCCA，

Actin_RPrimer：AATGAGTAACCACGCTCCGTC，

E 3_FP： GGCATATGCGAGCATTTTAT,

E 3_RP：TAGTACCATGCTTGGGTC。

以上引物由上海捷瑞生物公司合成，用去離子水將各引物稀釋到10μM工作濃度。

1.4 植物葉片DNA提取

植物葉片DNA按以下步驟提取。

1) 水稻葉片提取材料4 mg，裝入圓底EP管中，加1粒直徑4 mm的鋼珠，將管子浸入液氮中冷卻，待徹底冷卻后(2～3 min)，快速用振蕩研磨儀(頻率25次/s，時(shí)間30 s)將植物組織打碎。

2) 加入植物細(xì)胞裂解液300μL，上下顛倒5～6次，溶液變渾濁，室溫下放置待用，即得到植物材料DNA的粗提液。若無(wú)液氮，可先用小剪刀將葉片盡可能剪碎裝入1.5 mL 尖底EP管中，然后加入500μL 植物細(xì)胞裂解液振蕩破碎組織。

3) 將干凈脫脂棉簽浸入步驟二中的DNA的粗提液3 s，將浸潤(rùn)的棉簽迅速在DNA 漂洗液中輕輕漂洗3次，然后再將其在100μL 去離子水(ddH2O)或TE徹底洗脫3～5次，洗脫過(guò)的ddH2O即DNA溶液，可用于下游的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.5 PCR檢測(cè)

為了驗(yàn)證所提DNA是否滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增，選取水稻肌動(dòng)蛋白基因Actin設(shè)計(jì)的上述引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小為459 bp。按照以下PCR反應(yīng)體系配置反應(yīng)液20μL：2×Mixture,10μL；Actin-FPrimer，1μL；Actin-BPrimer，1μL：上述DNA溶液2μL；ddH2O 6μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，5 min；循環(huán)30個(gè)，95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；最后延伸72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物上樣量為10μL，電壓120 V，4 CM/V；恒壓電泳30～50 min。

1.6 DNA靈敏度檢測(cè)

為了檢測(cè)其靈敏度，對(duì)所提DNA溶液進(jìn)行了梯度稀釋。首先吸取2μL DNA溶液至8μL 去離子水中，再?gòu)南♂屓芤褐形?～8μL 去離子水，依次稀釋到107。以上述依次稀釋溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.7 DNA測(cè)序驗(yàn)證

為了檢測(cè)此方法所提DNA是否滿(mǎn)足克隆、測(cè)序的需要，用E 3_FP，E 3_RP引物對(duì)水稻OsBADH2基因的片段進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小為431 bp，用膠回收試劑盒將其回收，然后連接Peasy-T載體，轉(zhuǎn)化DH 5 α感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。膠回收步驟、連接體系、轉(zhuǎn)化方法和質(zhì)粒提取均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物葉片DNA提取

依據(jù)以上的提取方法，得到DNA粗提液效果見(jiàn)圖1。圓底EP管中，溶液呈翠綠色，植物組勻漿徹底，表明使用液氮效果較好。所得DNA溶液為Ⅰ。無(wú)液氮提取效果見(jiàn)圖2。此方法得到的DNA粗提溶液較前法較淡，一些葉片組織明顯未被破碎。但通過(guò)延長(zhǎng)破碎時(shí)間改善組織破碎效果。所得到DNA溶液為Ⅱ。

圖1 液氮研磨效果

圖2 無(wú)液氮研磨效果

2.2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

液氮研磨法和無(wú)液氮研磨法2種提取方法，分別用水稻Actin基因的上述引物進(jìn)行了PCR，其產(chǎn)物的凝膠電泳分別見(jiàn)圖3和圖4。兩圖中均有459 bp條帶擴(kuò)增，說(shuō)明2種方法所提DNA溶液滿(mǎn)足基因擴(kuò)增的需要。

圖3 液氮研磨法PCR擴(kuò)增

圖4 無(wú)液氮研磨法PCR擴(kuò)增

2.3 DNA溶液的靈敏度檢測(cè)

以液氮方法提取的DNA溶液梯度稀釋后作為模板，以水稻Actin基因設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳見(jiàn)圖5，從左到右稀釋倍數(shù)依次遞增。圖中結(jié)果表明，此方法提取的DNA溶液1 000萬(wàn)倍稀釋?zhuān)廊豢梢赃M(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。

圖5 DNA溶液靈敏度驗(yàn)證

2.4 目標(biāo)基因的測(cè)序分析

以E 3_FP，E 3_RP引物對(duì)水稻OsBADH2基因的片段擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖6，擴(kuò)增片段大小為431 bp；陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖7。測(cè)序峰圖清晰，經(jīng)比對(duì)完全與參考序列一致，此方法所提DNA完全滿(mǎn)足基因克隆、測(cè)序的需要。

圖6 OsBADH2 PCR 擴(kuò)增

圖7 BADH2測(cè)序圖

3 結(jié) 論

本研究以水稻幼苗葉片為試驗(yàn)材料，通過(guò)棉簽等吸附材料直接提取DNA，建立了一種簡(jiǎn)便、快速的DNA提取方法，大大加快了分子標(biāo)記輔助育種中基因型鑒定等繁鎖工作。同時(shí)，該方法對(duì)其它植物，如花生[28]，鐵皮石斛[29]、青稞[30]、燕麥[31]、南瓜[32]等葉片DNA提取有參考價(jià)值。

4 討 論

由于植物特有的細(xì)胞壁及胞內(nèi)物質(zhì)，很難輕易從植物中分離高產(chǎn)量和高質(zhì)量的DNA[6]。在選取材料時(shí)，應(yīng)盡可能的挑取處于生長(zhǎng)旺盛期的幼嫩組織。這時(shí)組織中蛋白質(zhì)、多糖及酚類(lèi)化合物都很少，并且由于細(xì)胞多數(shù)處于分裂旺盛期，DNA的產(chǎn)量也會(huì)很高，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)都推薦以幼嫩組織作為提取基因組DNA的首選材料[8-10]。葉片是十分理想的材料，葉片中維管組織含量少，提取效果較好。本試驗(yàn)中，選用4 mg新鮮、幼嫩水稻葉片為材料。通過(guò)組織破碎，發(fā)現(xiàn)葉片量不是越多越好，材料量適合，組織破碎均勻。圓底EP管較尖底EP管效果好，鋼珠在破碎儀作用下，更能夠在狹小的空間中將葉片組織破碎。漂洗液中Tween 20的作用主要是清洗雜質(zhì)。SDS是離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；且能解聚細(xì)胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。增大提取緩沖液中SDS的含量,有助于去除糖類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)[11-14]。本實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有使用RNAase I去除DNA溶液中的RNA，這對(duì)基于PCR的基因型鑒定沒(méi)有影響。本試驗(yàn)中的棉簽可以用濾紙等具有吸附作用的材料代替，作者用少量Whatman G/A 玻璃纖維濾紙固定在牙簽頭上，使用本方法提取步驟同樣獲得可以直接用于PCR擴(kuò)增的DNA。對(duì)于提取其他植物葉片組織或者其它組織DNA及其下游基因克隆等分子生物學(xué)操作，同樣可以借鑒本方法[15-27]。