鐘繼紅 徐磊 鄭華君

[摘要] 目的 觀察雷公藤多苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠結(jié)腸組織巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）和Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）的影響。 方法 按照隨機(jī)原則將BALB/c小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和雷公藤多苷低、中、高劑量組。采用右旋葡聚糖硫酸鈉法（DSS）復(fù)制BALB/c小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。正常對(duì)照組小鼠自由飲水，其余各組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。模型對(duì)照組予生理鹽水0.4 mL灌胃，不同劑量雷公藤多苷組分別以9.00、27.03和81.09 mg/kg濃度的雷公藤多苷混懸液0.40 mL灌胃，實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般情況，末次給藥后解剖觀察，組織切片染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織的病理學(xué)變化，采用ELISA酶聯(lián)法檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿蛋白MIF的含量，以熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸黏膜TLR4 mRNA表達(dá)。 結(jié)果 模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量和TLR4 mRNA水平較正常對(duì)照組明顯上升，而不同劑量雷公藤多苷組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量較模型對(duì)照組明顯下降（P<0.01），TLR4 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01）。 結(jié)論 雷公藤多苷通過(guò)降低MIF含量，進(jìn)而降低TLR4 mRNA表達(dá)，影響TLR4信號(hào)通路，從而達(dá)到抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤多苷；潰瘍性結(jié)腸炎；巨噬細(xì)胞游走抑制因子；Toll樣受體4

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）22-0032-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Tripterygium glycosides on the migration of macrophage migration inhibitory factor（MIF） and toll-like receptor 4（TLR4） in colonic tissue of mice with ulcerative colitis. Methods BALB/c mice were randomly divided into normal control group， model control group and low， medium and high doses of Tripterygium glycosides groups. Ulcerative colitis model of BALB/c mice was replicated by dextran sodium sulfate method （DSS）. The normal control group had free access to water， the remaining groups were administered intragastrically once a day for 7 days. The model control group was given normal saline 0.40 mL through intragastric administration. Different dose groups were given 0.4 mL of 9.00， 27.03 and 81.09 mg/kg tripterygium glycosides suspension through intragastric administration. General status of mice were observed daily during the experiment. After the last administration， we conducted anatomical observation and histological section staining to colonic tissue， and pathological changes of colonic tissue were observed under light microscope. The contents of MIF in colonic tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， and the expression of TLR4 mRNA in colonic mucosa was detected by fluorogenic quantitative PCR. Results MIF and TLR4 mRNA level in colonic tissues of model control group were significantly increased compared with those of normal control group. MIF levels in colonic tissues of different doses of tripterygium glycosides group were significantly lower than those of model control group（P<0.01）， and TLR4 mRNA expression was significantly reduced （P<0.01）. Conclusion Tripterygium glycosides can reduce MIF level， and then inhibit the expression of TLR4 mRNA and TLR4 signaling pathway， thereby achieving the effect of anti-ulcerative colitis.

[Key words] Tripterygium glycosides；Ulcerative colitis；Macrophage migration inhibitory factor； Toll-like receptor 4

UC是一種累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性反復(fù)發(fā)作性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，發(fā)病率逐年上升，預(yù)后較差。UC的發(fā)病機(jī)制中，腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致的局部持續(xù)性感染和炎癥損傷被認(rèn)為是重要環(huán)節(jié)[1]，而巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）和Toll樣受體4（TLR4）在其中起重要作用[2，3]。既往的研究證實(shí)，UC發(fā)病的機(jī)制可能通過(guò)激活MIF進(jìn)一步激活TLR4信號(hào)通路進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)：細(xì)菌LPS等胞外致炎信號(hào)刺激巨噬細(xì)胞高水平表達(dá)MIF，MIF上調(diào)TLR4 mRNA的表達(dá)，經(jīng)MyD88分別激活NF-κB、p38 MAPK和JNK信號(hào)通路，上調(diào)IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8，IL-17等促炎因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致UC的發(fā)病[4-6]。雷公藤多苷提取自中藥雷公藤，具有免疫調(diào)節(jié)作用，常用于治療免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、UC等，療效肯定[7，8]，但其作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不明確，本實(shí)驗(yàn)擬從其對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜MIF和TLR4 mRNA的影響上闡明其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康♂SPF級(jí)BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物

DSS（ Fluka：5000MW，31404）購(gòu)自Sigma公司；MIF 試劑（ELISA）購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司，批號(hào)1102261；雷公藤多苷片（10 mg/片），由浙江得恩德制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)z33020422。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、雷公藤多苷低、中、高不同劑量組。參考文獻(xiàn)[9]中的DSS造模方法制備慢性結(jié)腸炎模型，方法如下：除正常對(duì)照組外的小鼠自由飲用5%DSS溶液1周，然后每天觀察小鼠的生活狀態(tài)及大便情況。以大便帶血或大便次數(shù)增多或稀便或體重減輕視為造模成功。第8天隨機(jī)處死各組小鼠1只，剖腹取結(jié)腸，清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況，并取8 cm直乙交界處腸段（甲醛固定）做組織切片，以確定造模成功。

1.4 藥物混懸液配制及處理

按人-小鼠體表面積換算，分別用蒸餾水配制成低、中、高不同劑量雷公藤多苷混懸液（9.00、27.03和81.09 mg/kg）。然后每天不同劑量組各取0.40 mL混懸液分別對(duì)每只小鼠灌胃，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組均以0.40 mL生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。

1.5 一般情況觀察

自造模開(kāi)始每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)，活動(dòng)度，進(jìn)食飲水情況等。稱取各組小鼠的體質(zhì)量，記錄各組小鼠的大便情況，包括次數(shù)、形狀和出血情況等。

1.6 結(jié)腸組織采集和病理學(xué)觀察

治療給藥結(jié)束后，正常對(duì)照組小鼠直接采用頸部脫臼法處死，而其他4組小鼠皮下注射脂多糖（LPS），24 h后處死。取出結(jié)腸組織，沖洗干凈后觀察各組小鼠距肛8 cm結(jié)腸組織的大體改變，其中一部分結(jié)腸組織以10%中性甲醛溶液固定以備用，另一部分結(jié)腸組織用于制備組織勻漿，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 MIF含量檢測(cè)

取部分備用結(jié)腸組織稱重，進(jìn)行超聲勻漿，取上清液0.1 mL，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MIF的濃度。

1.8 TLR4表達(dá)水平檢測(cè)

結(jié)腸組織總RNA按Trizol法提取，具體參照RT試劑盒說(shuō)明的步驟。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)及Dunnett-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，豎毛，毛色失去光澤，凌亂，大便不成形，夾有血便及黏液便，次數(shù)增多，體質(zhì)量減輕。低、中、高劑量雷公藤多苷組的上述癥狀較模型對(duì)照組減輕。正常對(duì)照組小鼠活潑，體質(zhì)量、毛色、胃口及大便均正常。

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變

模型對(duì)照組：鏡下可見(jiàn)小鼠結(jié)腸組織明顯充血水腫，見(jiàn)破碎的細(xì)胞和腺體，層次不清，另見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜淺潰瘍形成；低劑量雷公藤多苷組：鏡下可見(jiàn)結(jié)腸組織水腫仍較明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜仍有散在淺潰瘍；中劑量及高劑量雷公藤多苷組：鏡下可見(jiàn)結(jié)腸組織水腫和充血基本消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，另可見(jiàn)已愈合的潰瘍組織；正常對(duì)照組：光鏡下可見(jiàn)結(jié)腸黏膜光滑完整，腺體清晰、層次清楚，未見(jiàn)中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等（封三圖4）。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織的MIF含量

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中MIF含量均低于模型組和不同劑量雷公藤多苷組（P<0.01），模型對(duì)照組高于不同劑量雷公藤多苷組，而不同劑量雷公藤多苷組中，低劑量組高于中劑量組，高于高劑量組。見(jiàn)表1。

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)水平

TLR4 mRNA表達(dá)水平在模型對(duì)照組和不同劑量雷公藤多苷組較正常對(duì)照組均有不同程度的升高，且不同劑量雷公藤多苷組的TLR4 mRNA表達(dá)水平較模型對(duì)照組顯著降低（P<0.01），但中劑量雷公藤多苷組與高劑量雷公藤多苷組與正常對(duì)照組TLR4 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎病因病機(jī)尚不明確，好發(fā)于年輕人，病程慢性遷延，反復(fù)發(fā)作，臨床治愈率低，給社會(huì)生產(chǎn)力和個(gè)人生活質(zhì)量帶來(lái)極大影響[10]。當(dāng)前臨床上常用水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑治療UC，但在UC緩解期治療時(shí)，藥物的可選擇性小，同時(shí)存在不良反應(yīng)多，難以堅(jiān)持用藥，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等缺點(diǎn)，造成患者的依從性低，從而引起疾病的復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC屬于“痢疾”、“泄瀉”、“腸風(fēng)”、“下利”等范疇，其基本病機(jī)是脾虛濕盛，健脾化濕為其治療大法。中藥在長(zhǎng)期維持治療中有不良反應(yīng)少、經(jīng)濟(jì)壓力小等優(yōu)勢(shì)。雷公藤多苷是從中藥雷公藤中提取出來(lái)的有效成分，具有抑制免疫的作用。劉端勇等[11]研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)于慢性炎癥性腸病模型小鼠采用雷公藤多苷治療有較好的療效，但確切的機(jī)制尚不清楚。鐘繼紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可通過(guò)TLR4信號(hào)通路作用于UC模型小鼠，但具體的作用靶點(diǎn)有必要進(jìn)一步深入，從而為下一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

MIF是一種具有多種生物功能的前炎癥因子，最初發(fā)現(xiàn)是在活化的T淋巴細(xì)胞中，故T淋巴細(xì)胞是MIF的重要來(lái)源之一。大量報(bào)道顯示在UC的發(fā)病過(guò)程中，MIF發(fā)揮了重要的作用，其主要抑制巨噬細(xì)胞的游走，促使活化免疫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥因子，參與免疫與炎癥疾病的進(jìn)展[13]。王柏濤等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用抗MIF單抗的UC小鼠與UC模型組小鼠比較，小鼠的糞便性狀、體重減輕幅度、結(jié)腸的大體表現(xiàn)及光鏡下黏膜改變等均有顯著改善，應(yīng)用免疫組化染色法觀察 MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)也不同程度的下降，進(jìn)一步證明抗MIF單抗對(duì)小鼠UC的發(fā)病的確能起到保護(hù)作用。易文等[15]研究發(fā)現(xiàn)，UC模型小鼠結(jié)腸組織中 MIF表達(dá)顯著升高，而光鏡下發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜層變薄，黏膜下層局部充血水腫、伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞散在分布。采用中藥經(jīng)方四逆散治療后能顯著改善上述異常變化。唐光耀等[16]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：抗MIF單抗能有效地減輕DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠的外在表現(xiàn)及結(jié)腸大體及組織的損傷，有一定的治療作用，對(duì)UC小鼠有一定的保護(hù)作用，從側(cè)面顯示了MIF在UC致病中的作用。

TLRs是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的重要模式識(shí)別受體 ，通過(guò)快速而準(zhǔn)確的感知及識(shí)別機(jī)體“自我”及“非我”的保守分子模式PAMPS以激活天然免疫系統(tǒng)，同時(shí)作為預(yù)警信號(hào)，向抗原遞呈細(xì)胞（antigen presentcen，APC）發(fā)出警報(bào)，從而激活T細(xì)胞而啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)[17]。LPS/TLR4在機(jī)體免疫反應(yīng)中的重要作用得到眾多學(xué)者的公認(rèn)，近來(lái)TLR4也被認(rèn)為是腸道免疫反應(yīng)的一類關(guān)鍵介質(zhì)，TLR4 mRNA在正常的結(jié)腸黏膜中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在UC的結(jié)腸黏膜中則呈現(xiàn)異常的高表達(dá)[18-19]。趙承滿等[20]證實(shí)烏司他丁能減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與通過(guò)下調(diào)TLR4 mRNA及NF-κB的表達(dá)，減少炎癥因子TNF-α的釋放有關(guān)。

本研究成功復(fù)制了小鼠慢性結(jié)腸炎的模型，該模型廣泛應(yīng)用于UC免疫病理機(jī)制的研究，同時(shí)用于評(píng)估新藥的療效。該模型小鼠結(jié)腸主要表現(xiàn)為黏膜廣泛充血水腫糜爛，腺體紊亂，層次不清，淺潰瘍形成，同時(shí)伴有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，符合人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理改變。本研究結(jié)果表明：雷公藤多苷能有效治療DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥，主要表現(xiàn)在治療組小鼠結(jié)腸組織中MIF和TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著降低，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），從研究結(jié)果可以得出結(jié)論：雷公藤多苷抑制結(jié)腸組織中MIF和TLR4 mRNA的表達(dá)可能是其治療UC的作用靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-03-22）