羅莉婭，鄧星，茍立平，溫倩雯，萬麗*

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinese(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)。習(xí)稱“北五味子”，具有斂肺滋腎，生津斂汗，澀精止瀉，寧心安神的功效[1]。五味子主要成分為木脂素類。五味子作為臨床常用藥和大多數(shù)保健品的重要原料，使用范圍廣泛，用量大。

中藥對(duì)照提取物專屬性較強(qiáng)，配制操作簡單，價(jià)格低廉，既能用于薄層色譜法，對(duì)藥材進(jìn)行定性鑒別，也可以標(biāo)示多個(gè)單體成分的含量，在定性鑒別中，可以達(dá)到與多個(gè)對(duì)照品同時(shí)鑒別相同的效果，中藥對(duì)照提取物的研究已經(jīng)成為中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的趨勢(shì)[2,3]。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試考察薄層用五味子對(duì)照提取物的純化工藝，同時(shí)對(duì)制得的五味子對(duì)照提取物的包裝儲(chǔ)藏進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1200Series高效液相色譜儀（安捷倫公司)；DSY-1-2孔電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；BP211D（十萬分之一）型電子天平（德國Sartorius公司）；ZF-90型暗箱式紫外透射儀（上海顧村電光儀器廠）；UPT-Ⅱ-10T優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 材料

五味子藥材購于成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定學(xué)標(biāo)本館盧先明教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinese(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)。依照《中國藥典》2015年版一部五味子藥材項(xiàng)下要求檢查質(zhì)量均合格。五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào):MUST-16021905，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào):MUST-15082302，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子酯乙對(duì)照品（批號(hào):MUST-15111112，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子甲素對(duì)照品（批號(hào):MUST-16022401，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子乙素對(duì)照品（批號(hào):MUST-15112611，純度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子對(duì)照藥材（批號(hào):120918-201110，中國食品藥品檢定研究所）；流動(dòng)相為色譜甲醇，其他有機(jī)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子對(duì)照提取物純化工藝考察[4]

本實(shí)驗(yàn)主要以五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素為指標(biāo)，HPLC測(cè)定，采用單因素法對(duì)純化過程中樹脂型號(hào)、樹脂用量、提取液濃度、洗脫劑濃度、洗脫劑用量等參數(shù)進(jìn)行考察，并采用薄層色譜對(duì)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenexluna 5μ C18100A 250*4.60 mm；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水，按下表1中的比例進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長250 nm，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 HPLC梯度洗脫條件

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 對(duì)照品溶液的配制：分別稱取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素適量，用甲醇定容成1 mg·mL-1，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。HPCL測(cè)定，結(jié)果如圖1。

圖1 五味子混合對(duì)照品HPLC圖

2.1.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取大孔吸附樹脂適量，95%乙醇浸泡24 h，裝柱。采用95%乙醇洗脫至乙醇:水（1:5）不變渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，抽濾至不滴水為準(zhǔn)，備用[4]。

2.1.4 五味子提取液的的制備[5]取五味子藥材粗粉100 g，置于2000 mL圓底燒瓶中，精密加入10倍量濃度為95%的乙醇。加熱回流兩次，每次1 h，搖勻，紗布濾過，合并兩次濾液，抽濾后減壓回收乙醇，用蒸餾水定容至1000 mL，即得（生藥濃度0.1 g·mL-1）。

2.1.5 大孔樹脂型號(hào)考察 取預(yù)處理后的D101、HPD100、HPD400、A8-8，4種樹脂各7 g，置150mL錐形瓶，平行2份，精密加入50 mL濃度為0.1g·mL-1（含藥材5 g）的五味子提取液，時(shí)時(shí)振搖，放置24 h后，過濾，取續(xù)濾液15 mL，用甲醇定容至20 mL， HPLC測(cè)定濾液濃度，計(jì)算每種樹脂吸附量。用等量蒸餾水沖洗大孔樹脂，除去水溶性多糖、無機(jī)鹽離子等雜質(zhì)，最后將抽濾后的樹脂轉(zhuǎn)移到另1個(gè)具塞磨口三角瓶中，加入100 mL濃度為95%的乙醇密封靜置，時(shí)時(shí)振搖，放置24 h以靜態(tài)洗脫樹脂，過濾大孔樹脂，濾液置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘留物用甲醇定容至100 mL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。測(cè)定解吸液濃度，計(jì)算每種樹脂的解吸率[6]，結(jié)果見表2。

表2 不同型號(hào)樹脂的吸附量和解吸率

總吸附量(mg)=(吸附前溶液濃度-吸附后溶液濃度)×溶液體積

吸附量(mg·g-1)=(吸附前溶液濃度-吸附后溶液濃度)×溶液體積/干樹脂質(zhì)量

解吸率(%)=(洗脫液的平衡濃度×洗脫液體積)/總吸附量× 100%

結(jié)果表明，型號(hào)為AB-8的樹脂吸附率和解析率都較高，能較好地吸附五味子當(dāng)中的木脂素成分，所以選擇AB-8的大孔樹脂吸附五味子提取液。

2.1.6大孔樹脂用量的考察[7]分別稱取4 g、5 g、6g、7 g、8 g型號(hào)為AB-8的大孔樹脂置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.1 g·mL-1的提取液50 mL，振搖后靜置24 h。將已吸附24 h不同量的樹脂，抽濾，取續(xù)濾液15 mL，用甲醇定容至20 mL，微孔濾膜過濾，濾液HPLC檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3 不同樹脂用量3種成分的吸附量

結(jié)果表明，當(dāng)用7 g型號(hào)為AB-8的樹脂吸附50 mL濃度為0.1 g·mL-1的提取液時(shí)，在樹脂用量較少的情況下保持吸附率和解析率較高，為節(jié)約成本，樹脂用量為7 g。

2.1.7 提取液濃度的考察 分別量取4份50 mL五味子提取液于錐形瓶中，分別加蒸餾水稀釋至1、1.25、1.5、2倍，再分別加入A8-8大孔樹脂各7 g，封口，振搖后靜置24 h。分別抽濾并取續(xù)濾液，按2.1.6.1項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 不同提取液濃度3種成分的吸附量

結(jié)果表明，當(dāng)五味子提取液不稀釋時(shí)，即提取液濃度為0.1 g藥材/mL，吸附率和解析率較高，且蒸餾水用量較少。故提取液的最佳濃度為0.1 g藥材/mL。

2.1.8 洗脫劑濃度的考察 分別稱取3份AB-8的樹脂各7 g，分別加入50 mL濃度為0.1 g·mL-1的五味子提取液，靜置并時(shí)時(shí)震搖24 h后濾過，蒸餾水洗滌，抽濾后的樹脂分別加入50 mL濃度為75%、85%、95%的乙醇，振搖后靜置24 h過濾，濾液置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘留物用甲醇定容至100 mL，微孔濾膜濾過，濾液用HPLC檢測(cè)。結(jié)果見表5。

表5 不同洗脫劑濃度3種成分的解吸率

結(jié)果表明，使用95%乙醇，解吸率最高，故選擇95%濃度乙醇作為洗脫劑。

2.1.9 洗脫劑用量的考察 稱取5份AB-8樹脂各7 g，分別加入50 mL濃度為0.1 g·mL-1的提取液，振搖后靜置24 h，抽濾，抽濾后的樹脂分別加入50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL95%的乙醇振搖后并靜置，24 h后過濾，后按2.1.6.3項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 不同洗脫劑用量3種成分的解吸率

結(jié)果表明，70 mL乙醇能較好地把五味子中的木脂素成分洗脫下來，為避免浪費(fèi)，故洗脫劑的最佳用量為70 mL。

2.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的最佳純化參數(shù)，制備得到五味子提取物用95%乙醇溶解得到每mL含1 g五味子藥材的五味子對(duì)照提取物溶液，與對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液，各取2 μL點(diǎn)于同一硅膠GF254的薄層板上，以石油醚（30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm )下檢視，結(jié)果如圖2。

圖2 五味子對(duì)照藥材薄層色譜圖

2.3 五味子對(duì)照提取物包裝

五味子對(duì)照提取物主要成分為木脂素類成分，如五味子醇甲，五味子甲素，五味子乙素，較難干燥，且含有較多的糖分，干燥后為黃色油狀液體，不容易分裝，因?yàn)檎吵矶容^大，容易吸潮，不易干燥，也不易長期保存。綜上所述，考慮直接用適當(dāng)溶劑溶解油狀對(duì)照提取物，再分裝成一次取用量使用。

安瓿瓶密封性好，防止吸潮，使用方便，故選擇安瓿瓶封裝保存。通過查閱文獻(xiàn)可知，五味子對(duì)照提取物常用的溶劑有甲醇、乙醇、三氯甲烷，三種溶劑溶解對(duì)照提取物點(diǎn)樣效果相同。而乙醇毒性最小，溶解度較大，揮發(fā)性較小，且本身具有殺菌作用，適用于長期保存，故選擇乙醇作為五味子對(duì)照提取物的溶劑。

濃度考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 g藥材/mL濃度的對(duì)照提取物溶液取2 μL時(shí)的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材2 μL效果相同，故最佳濃度為1 g藥材/mL，這時(shí)達(dá)到了等量同質(zhì)的效果。

3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制得的五味子對(duì)照提取物用乙醇溶解為濃度1 g藥材/mL的溶液，將溶液取最小分裝量1 mL封裝于1 mL容量的棕色安瓿瓶內(nèi)，進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，測(cè)定高溫穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其性質(zhì)穩(wěn)定，易于保存。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)五味子對(duì)照提取物的純化條件和包裝工藝進(jìn)行研究，得到了最佳工藝參數(shù)，并在后期考察了五味子對(duì)照提取物的穩(wěn)定性，對(duì)五味子對(duì)照提取物的研究奠定了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。五味子對(duì)照提取物制備方法較為簡單，可適用于工業(yè)生產(chǎn)。制得的五味子對(duì)照提取物的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好，與1g五味子對(duì)照藥材等量同質(zhì)，使用簡單，易于儲(chǔ)藏，可用于五味子的藥材定性鑒別。