徐蓉,豐宇芳,陳正紅2#蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院病理科,江蘇 張家港 25600

2江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科,南京2100280

微小RNA(micro RNA,miRNA)由一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈分子組成,其特點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄后可以水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[1],對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及凋亡均有非常重要的意義[1-2].相關(guān)研究表明,miRNA參與體內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,并且可以廣泛調(diào)控腫瘤基因的表達(dá),因此推測(cè)miRNA可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[3].結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是全球發(fā)病率極高的一種腫瘤,病死率極高[4-5].結(jié)腸癌多表現(xiàn)為多基因及表觀(guān)遺傳改變[5].大量研究表明,在結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程中,某些特定的miRNA起著重要調(diào)控作用,因此這些特定的miRNA可以成為結(jié)腸癌診斷和生物治療的新靶標(biāo)[6-9].還有研究顯示,miRNA-95這類(lèi)微小RNA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)癌基因,從而對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到一定的作用[8,10-11].還有部分相關(guān)類(lèi)型研究報(bào)道顯示,miRNA-95能夠通過(guò)抑制SNX1的表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[8].但是關(guān)于miRNA-95-3p能否通過(guò)對(duì)其他基因進(jìn)行調(diào)控,從而對(duì)結(jié)腸癌產(chǎn)生一定影響的研究尚少,因此,本研究對(duì)miRNA-95-3p在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖、遷移能力的影響進(jìn)行探討,現(xiàn)報(bào)道如下.

1 材料與方法

1.1 病理組織收集

收集2017年1-10月蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院采集并保存的結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織.納入標(biāo)準(zhǔn):①病理組織保存完好、完整,可用于后期實(shí)驗(yàn)操作;②與組織相匹配的患者信息全面,具有明確的結(jié)腸癌診斷信息;③除腫瘤組織外,還有對(duì)應(yīng)的癌旁正常腸黏膜組織.排除標(biāo)準(zhǔn):①病理組織有反復(fù)凍融情況,保存缺失不完整、不完好;②組織對(duì)應(yīng)的患者病歷資料不完整,無(wú)明確診斷信息;③無(wú)對(duì)應(yīng)的癌旁正常腸黏膜組織.根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),本研究共選取10例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織.

1.2 細(xì)胞株及質(zhì)粒

結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株購(gòu)自博士德生物工程公司(武漢);雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)(pmirGLO Vector)委托吉瑪公司(中國(guó)上海)構(gòu)建與合成,該質(zhì)粒體系概述如下:首先進(jìn)行p21的3'-UTR區(qū)域全基因片段合成,在片段區(qū)域兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),插入熒光蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase)3'-UTR的克隆位點(diǎn);該質(zhì)粒也包含海腎熒光素酶(renilla luciferase)基因.

1.3 主要試劑

胎牛血清及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Roch公司,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)特異性定量引物和內(nèi)參U6均由廣州市銳博生物科技有限公司合成.OMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW620細(xì)胞接種于含10%胎牛血清+1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);SW620細(xì)胞復(fù)蘇后,以(2～5)X105/ml密度種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),12 h后觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),采用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代(約2天1次),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-95-3 p表達(dá) 按照總RNA提取試劑操作說(shuō)明提取結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織中的總RNA,采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度.以上述提取的總RNA中的mRNA作為模板,按照mRNA逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將所提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,保存于-20℃?zhèn)溆?將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物制備稀釋后采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒于實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)miRNA-95-3p的表達(dá)情況,每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)平行孔,共進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).每次檢測(cè)均以U6為內(nèi)參照,通過(guò)熒光定量法2-△△Ct計(jì)算miRNA-95-3p的相對(duì)表達(dá)量.

1.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞,對(duì)SW620細(xì)胞進(jìn)行分組:過(guò)表達(dá)組,轉(zhuǎn)染miRNA-95-3p mimics;對(duì)照組,不進(jìn)行轉(zhuǎn)染.調(diào)整兩組細(xì)胞濃度為(1.0～1.5)X106/ml,接種于6孔板中,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.將完全培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清和雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,每孔培養(yǎng)基1 ml,隨后用100 μl OMEM稀釋miRNA-95-3p mimics及LipofectamineTM2000,依照說(shuō)明書(shū)推薦比例混勻后靜置20 min,然后將混合溶液逐滴加入對(duì)應(yīng)孔并輕晃混勻;溫箱放置6 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集兩組細(xì)胞進(jìn)行下一步分析.

1.4.4 CCK-8法檢測(cè)SW620細(xì)胞的增殖情況 取過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組SW620細(xì)胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1X105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)基200 μl,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8試劑200 μl,再持續(xù)培養(yǎng)2 h.采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處光密度值(optical density,OD),以對(duì)應(yīng)的OD值表示細(xì)胞增殖能力.

1.4.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 取過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組SW620細(xì)胞,采用0.25%胰蛋白酶消化上述2組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1X105/ml,接種于6孔板中,置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),待細(xì)胞增長(zhǎng)至匯合度80%以上時(shí),用10 μl微量移液頭消毒后在6孔細(xì)胞板上垂直劃痕,采用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細(xì)胞3次,24 h后在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的遷移情況.

1.4.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞 p21蛋白的表達(dá) 收集培養(yǎng)48 h的過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組SW620細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測(cè)量細(xì)胞總蛋白濃度,然后在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠小孔內(nèi)添加50 μg經(jīng)過(guò)變性處理后的蛋白質(zhì),再進(jìn)行濃縮膠層80 V恒壓至樣品在分離膠層壓成一條線(xiàn)時(shí),電壓調(diào)至120 V,繼續(xù)電泳,電泳后于冰水混合物中300 mA轉(zhuǎn)膜2 h,麗春紅染色10 min觀(guān)察轉(zhuǎn)移效果,隨后在5%脫脂奶粉的搖床上孵育2 h;加入一抗(1∶500兔抗人p21多抗,1∶5000兔抗人GAPDH單抗)置于4℃孵育過(guò)夜;洗膜后加入羊抗兔IgG/HRP二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影得到蛋白印跡條帶,采用Tanon軟件分析條帶灰度值,以β-actin為內(nèi)參,相對(duì)定量結(jié)果以灰度值/光密度值表示.

1.4.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1X105/ml,接種于48孔板中,常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度至70%后,用于后續(xù)轉(zhuǎn)染操作.將接種于48孔板的SW620細(xì)胞分為4組:A組,共轉(zhuǎn)染pMIR-NC質(zhì)粒和miRNA-95-3p;B組,共轉(zhuǎn)染pMIR-p21質(zhì)粒和miRNA-control組;C組,共轉(zhuǎn)染pMIR-NC質(zhì)粒和miRNA-control組;D組,共轉(zhuǎn)染pMIR-p21質(zhì)粒和miRNA-95-3p組;轉(zhuǎn)染方法同"1.4.3",轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn).去除每孔內(nèi)完全培養(yǎng)基,加入適量的報(bào)告基因細(xì)胞裂解液,而后每孔加入100 μl螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)緩沖液;采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)孔內(nèi)相對(duì)光單位(relative light unit,RLU),而后每孔加入海腎熒光素酶檢測(cè)工作液后再次測(cè)定RLU.每孔熒光素酶活性相對(duì)值=螢火蟲(chóng)熒光素酶RLU/海腎熒光素酶RLU.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟-件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,多組組間兩兩比較比較采用SNK法.以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miRNA-95-3 p相對(duì)表達(dá)量的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中miRNA-95-3p的相對(duì)表達(dá)量為(2.57±0.26),明顯高于癌旁正常腸黏膜組織的(1.00±0.24),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.69,P<0.01).

2.2 SW620細(xì)胞增殖能力的比較

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)組SW620細(xì)胞的增殖能力為(1.38±0.24),明顯高于對(duì)照組的(0.68±0.16),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.20,P<0.01).

2.3 SW620細(xì)胞體外遷移能力的比較

過(guò)表達(dá)組SW620細(xì)胞的劃痕區(qū)域相對(duì)寬度為(81.1±3.7)%,明顯高于對(duì)照組的(47.6±7.3)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.09,P<0.01).

2.4 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中 p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組SW620細(xì)胞中p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.11),過(guò)表達(dá)組SW620細(xì)胞中p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.64±0.19),過(guò)表達(dá)組SW620細(xì)胞中p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.84,P<0.05).

2.5 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞熒光素酶活性的比較

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:4組SW620細(xì)胞的熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=183.16,P<0.01).其中,B組、D組SW620細(xì)胞的熒光素酶活性均較C組和A組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),A組SW620細(xì)胞的熒光素酶活性與C組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組SW620細(xì)胞的熒光素酶活性與D組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).(表1)

表1 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞熒光素酶活性的比較(±s)

表1 轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞熒光素酶活性的比較(±s)

注:a與D組比較,P<0.05;b與C組比較,P<0.05;c與B組比較,P<0.05

指標(biāo)熒光素酶活性5.43±0.09a c 3.71±0.18a b 5.82±0.15a c 2.84±0.26b A組B組C組D組

3 討論

結(jié)腸癌是一種比較常見(jiàn)的惡性腫瘤,病死率較高[5].多數(shù)結(jié)腸癌患者被確診時(shí)已處于中晚期,盡管目前針對(duì)結(jié)腸癌的治療方法不斷革新,包括了傳統(tǒng)手術(shù)治療以及放化療在內(nèi)的保守治療等,但是各種治療方法對(duì)于晚期結(jié)腸癌患者的治療效果均不是很理想.由于結(jié)腸癌早期診斷方法的不完善,導(dǎo)致患者的最佳治療時(shí)期被延誤,多數(shù)結(jié)腸癌患者的術(shù)后5年生存率仍較低[12].因此,對(duì)結(jié)腸癌早期診斷方法的改革已經(jīng)成為臨床急需解決的關(guān)鍵難點(diǎn).結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多基因共同參與、多步驟完成的復(fù)雜生物學(xué)形成過(guò)程,這也提示需要從多種分子水平對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究.通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制的探索,有利于全面了解結(jié)腸癌的發(fā)生過(guò)程,進(jìn)而有利于尋找新的治療靶標(biāo)[13].

目前,生命科學(xué)的研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代,人們對(duì)基因的研究首先轉(zhuǎn)變成先了解基因序列,再通過(guò)逆基因手段抑制目標(biāo)基因表達(dá),最后才觀(guān)察表型的變化,而miRNA則是目前的研究熱點(diǎn)[14].相關(guān)研究顯示,人體內(nèi)超過(guò)30%～35%的蛋白質(zhì)編碼基因都受到了miRNA的調(diào)控,miRNA基本上影響了所有的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1].大多數(shù)的癌基因和抑癌基因均是miRNA的靶基因,因而在腫瘤中miRNA的靶基因可以作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性,或者作為癌基因下調(diào)抑癌基因的活性[15-16].近年來(lái),miRNA在結(jié)腸癌中的研究備受關(guān)注,因其特別的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式,從而為結(jié)腸癌的研究提供了一類(lèi)嶄新的思路和方式.由于miRNA在結(jié)腸癌中的異常表達(dá)逐漸被發(fā)現(xiàn),其部分的作用靶點(diǎn)和機(jī)制得以初步闡明[6-8,17].但是,miRNA在結(jié)腸癌中起到許多關(guān)鍵性的作用依舊未見(jiàn)報(bào)道.

已有研究表明,miRNA-95參與了肺癌、神經(jīng)角質(zhì)素瘤、肝癌等多種類(lèi)型腫瘤的發(fā)生過(guò)程,其通過(guò)調(diào)控下游多種靶基因?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行調(diào)節(jié)[8,10-11,18-20].近年來(lái)有相關(guān)報(bào)道指出,miRNA-95能進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[8].在結(jié)腸癌的發(fā)展過(guò)程中,細(xì)胞周期遭到破壞是導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要原因之一.細(xì)胞周期蛋白可以調(diào)控細(xì)胞周期,通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行抑制,可以抑制各類(lèi)腫瘤的發(fā)生.p21是由CDKN1A基因編碼的一種蛋白質(zhì),已有研究表明,p21蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)的抑制藥[21-22],通過(guò)p21蛋白對(duì)CDK2和CDK4的活性進(jìn)行抑制,從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)入S期[22].相關(guān)研究表明,miRNA-95-3p能抑制hepG2細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá),從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖[19].

本研究對(duì)miRNA-95-3p與結(jié)腸癌的關(guān)系進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織中miRNA-95-3p的表達(dá)水平較癌旁正常腸黏膜組織明顯升高.表明在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,miRNA-95-3p起到了實(shí)質(zhì)性關(guān)鍵作用.為了更好地尋找結(jié)腸癌的診斷突破點(diǎn),為結(jié)腸癌的治療提供新的思路和靶點(diǎn),本研究還對(duì)miRNA-95-3p的表達(dá)情況進(jìn)行了進(jìn)一步分析.為了能更深層次的研究miRNA-95-3p對(duì)結(jié)腸癌的影響,本研究對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miRNA-95-3p后能夠明顯提升SW620細(xì)胞的增殖及遷移能力.表明過(guò)表達(dá)miRNA-95-3p可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移.為了研究miRNA-95-3p促進(jìn)SW620細(xì)胞增殖及遷移的分子機(jī)制,本研究對(duì)SW620細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并檢測(cè)p21蛋白的表達(dá)量.結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)染miRNA-95-3p能夠抑制SW620細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá).雖然該實(shí)驗(yàn)?zāi)艽_定p21與miRNA-95-3p的調(diào)控相關(guān)性,但是卻不能鑒定miRNA-95-3p的靶位點(diǎn).為了更進(jìn)一步確定miRNA-95-3p在結(jié)腸癌中是否與p21的3'-UTR直接作用,本研究進(jìn)行了雙熒光素酶實(shí)驗(yàn).目前,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)是miRNA靶位點(diǎn)鑒定的常見(jiàn)的一種方法,該報(bào)告系統(tǒng)由兩部分構(gòu)成,分別是熒光素酶表達(dá)載體和包含目的miRNA靶基因3'-UTR克隆的熒火蟲(chóng)熒光素酶基因標(biāo)記報(bào)告質(zhì)粒;通過(guò)將表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中表達(dá),當(dāng)細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因時(shí)熒光素酶激活表達(dá)載體,通過(guò)吸收光檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的miRNA靶位點(diǎn)的鑒定.如相對(duì)應(yīng)基因的3'-UTR中含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn),則細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的miRNA將結(jié)合于靶基因3'-UTR,得以阻礙了螢火蟲(chóng)熒光素酶的翻譯.當(dāng)過(guò)表達(dá)miRNA-95-3p和含有p21的3'-UTR的雙熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞時(shí),螢火蟲(chóng)熒光素酶活性明顯下降,驗(yàn)證了miRNA-95-3p在SW620細(xì)胞中是與p21的3'-UTR相結(jié)合.

綜上所述,本研究驗(yàn)證了miRNA-95-3p在結(jié)腸癌組織中的異常表達(dá),并且異常表達(dá)的miRNA-95-3p參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡等生物學(xué)行為的改變,提示miRNA-95-3p與結(jié)腸癌進(jìn)程的參與性.因此,miRNA-95-3p很有可能可以成為結(jié)腸癌基因治療中的新靶點(diǎn).從作用機(jī)制上來(lái)說(shuō),miRNA-95-3p可以直接結(jié)合單p21的3'-UTR區(qū)域?qū)21蛋白表達(dá)產(chǎn)生一定的影響,從而抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展.