陸 娜，王偉科，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），原產(chǎn)于印度，又名印度鮑魚(yú)菇，隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目 （Agaricales） 白蘑科 （Tricholomataceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），屬于平菇大類中的肺型側(cè)耳，原系熱帶和亞熱帶的1種野生食用菌，經(jīng)馴化育種后開(kāi)始人工栽培[1]，秀珍菇是近年來(lái)從眾多食用菌品種中脫穎而出的最受消費(fèi)者喜愛(ài)的優(yōu)良食用菌品種之一[2]。隨著秀珍菇設(shè)施栽培模式的不斷更新和改進(jìn)，由傳統(tǒng)春秋兩季栽培模式逐漸向栽培效率和收益更高的夏季設(shè)施栽培模式發(fā)展，然而適合高效設(shè)施栽培的環(huán)境專用型品種卻未能得到及時(shí)有效地更新同步，可供企業(yè)、菇農(nóng)選擇的栽培品種較少，同時(shí)已應(yīng)用的品種經(jīng)常出現(xiàn)異種同名或同種異名現(xiàn)象，因此造成秀珍菇品種混亂[3]，加上秀珍菇設(shè)施栽培生產(chǎn)中常出現(xiàn)菇體色澤不佳、菇蓋薄、易破碎、出菇整齊度不高等問(wèn)題，目前急切需要色灰、蓋厚、不易碎、出菇整齊度高，適應(yīng)反季節(jié)設(shè)施栽培模式的優(yōu)質(zhì)秀珍菇品種，以滿足市場(chǎng)不斷提高的質(zhì)量要求，為促進(jìn)杭州市秀珍菇產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)步發(fā)展提供品種和技術(shù)支撐。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以輔助提供有效的基因組信息，在側(cè)耳的分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究中具有可行性，能快速確定各栽培菌株之間的遺傳關(guān)系，其可以產(chǎn)生豐富的多態(tài)位點(diǎn)，更好地揭示了種下分類群間的關(guān)系[4]。因此，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合秀珍菇栽培特性進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性分析，旨在為篩選出適合高效設(shè)施栽培的秀珍菇菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和來(lái)源

供試的36個(gè)秀珍菇菌株均由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所菌種站從秀珍菇主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁培養(yǎng)，采用同一菌齡的菌株開(kāi)展試驗(yàn)后所得，詳見(jiàn)表1。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

菌絲體培養(yǎng)：從PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌落邊緣取2 mm×2 mm的菌絲塊，接種于100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，25℃淺層靜置培養(yǎng)10 d，收集菌絲，無(wú)菌水漂洗2次后，無(wú)菌濾紙吸干水分，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

母種培養(yǎng)：采用PDA培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下進(jìn)行接種后放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d左右，于-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原種培養(yǎng)：采用棉籽殼78%、麩皮20%、石灰1%、石膏1%，含水量為65%的培養(yǎng)基，高壓滅菌后在無(wú)菌條件下接種，放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

栽培種培養(yǎng)：采用棉籽殼39%、木屑39%、麩皮20%、石灰2%，含水量為63%的培養(yǎng)基，高壓滅菌后在無(wú)菌條件下接種，放置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 秀珍菇基因組DNA的提取和濃度測(cè)定

供試的36個(gè)秀珍菇菌株的DNA提取方法參照新型快速植物基因組DNA提取試劑（百泰克生物技術(shù)有限公司BioTeke，北京） 的說(shuō)明，提取后測(cè)定DNA濃度，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISSR引物選擇

從美國(guó)哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR通用引物中篩選出18條ISSR引物，具體見(jiàn)表2，然后委托杭州擎科生物公司進(jìn)行合成。

1.5 ISSR多態(tài)性分析

ISSR-PCR的擴(kuò)增體系為：2×TSINGKE PCR Maste（rblue）預(yù)混體系10 μL，ISSR引物1 μL，DNA模板（20 ng·μL-1）3 L，加 dd H2O 補(bǔ)齊到 20 μL。

ISSR的PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TC-XP型（博日科技有限公司Bioer，杭州）上進(jìn)行。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，適當(dāng)退火溫度退火30 s（退火溫度視引物而定，詳見(jiàn)表2），72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，于16℃保存。

PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB染色）進(jìn)行電泳檢測(cè)，150 V下電泳30 min。擴(kuò)增圖譜的攝取采用Chemi Doc XRS imaging system（Bio-Rad，Hercules，CA，USA） 進(jìn)行拍照，有ISSR帶譜的統(tǒng)計(jì)為1，無(wú)ISSR帶譜的統(tǒng)計(jì)為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣，采用NTSYSpc2.1軟件計(jì)算遺傳相關(guān)系數(shù)，非加權(quán)組平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means） 進(jìn)行聚類分析，得出聚類圖譜。

表1 供試秀珍菇菌株Tab.1 Tested strains of Pleurotus geesteranus

表2 ISSR引物名稱及退火溫度Tab.2 The name of ISSR primers and the annealing temperature

1.6 出菇試驗(yàn)

出菇試驗(yàn)在秀珍菇設(shè)施化栽培大棚中進(jìn)行，每個(gè)菌株挑取發(fā)菌完好的菌袋150袋，每50袋1次重復(fù)，設(shè)3次重復(fù)，每袋干料重650 g。以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)為主要指標(biāo)進(jìn)行篩選，記錄前3潮產(chǎn)量和各菌株農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析與菌株聚類

ISSR多態(tài)性分析與菌株聚類試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 引物UBC827的PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification map of primer UBC827

由圖1可以看出，利用ISSR引物對(duì)36個(gè)秀珍菇菌株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ISSR-PCR擴(kuò)增圖譜顯示，其中18條ISSR引物在36個(gè)秀珍菇菌株間擴(kuò)增出146條清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性片段，片段長(zhǎng)度在 500 bp～2 000 bp。

2.2 DNA擴(kuò)增圖譜聚類分析

基于ISSR擴(kuò)增圖譜進(jìn)行36個(gè)秀珍菇菌株DNA擴(kuò)增圖譜聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于ISSR分析的秀珍菇菌株聚類樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster dendrogram of Pleurotus geesteranus strains based on ISSR analysis

由圖2可以看出，不同來(lái)源秀珍菇菌株遺傳相似系數(shù)在0.66～1.00，當(dāng)相似系數(shù)為0.66時(shí)，其可被分為2個(gè)類群；當(dāng)相似系數(shù)為0.82時(shí)，被分為4個(gè)類群；而當(dāng)相似系數(shù)為1.00時(shí)，被分為7個(gè)類群。其中秀珍菇菌株X18和X27聚為1組；菌株X15、X38、X28、X29聚為1組；菌株X13、X31、X12、X35各為單獨(dú)1組；其余26個(gè)秀珍菇菌株聚為1組，相似系數(shù)為1.00，很有可能為同一個(gè)菌株。36個(gè)秀珍菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.66～1.00，表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

2.3 菌株農(nóng)藝性狀比較

通過(guò)遺傳多樣性分析，從36個(gè)秀珍菇菌株中選擇9個(gè)代表性菌株，按編號(hào)1～9分別是X3、X4、X28、X11、 X35、X23、X12、 X27、X31，主栽菌株TX5766（編號(hào)為10）作為對(duì)照品種，進(jìn)行出菇試驗(yàn)并評(píng)價(jià)。

2.3.1 秀珍菇菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量比較

秀珍菇菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可知，各秀珍菇菌株平均滿袋天數(shù)和產(chǎn)量間均存在顯著差異。菌絲生長(zhǎng)最快的是4號(hào)、10號(hào)菌株，滿袋天數(shù)分別為45 d和45.5 d；最慢的是1號(hào)菌株，滿袋天數(shù)為50 d。從前3潮菇產(chǎn)量來(lái)看，5號(hào)菌株平均產(chǎn)量最高，達(dá)0.326 kg·袋-1，其次是10號(hào)菌株，為0.283 kg·袋-1，5號(hào)菌株平均產(chǎn)量比對(duì)照菌株高15.2%；而其余參試菌株的平均產(chǎn)量均低于主栽對(duì)照菌株10號(hào)。

表3 秀珍菇菌株產(chǎn)量比較Tab.3 Comparison of yields of Pleurotus geesteranus

2.3.2 各參試菌株栽培和商品性狀比較

各參試菌株栽培和商品性狀比較，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，秀珍菇5號(hào)、10號(hào)、8號(hào)3個(gè)菌株菌蓋顏色深灰色，比較符合市場(chǎng)中菌蓋色深的要求；而從出菇密度方面分析，秀珍菇5號(hào)、10號(hào)、1號(hào)和2號(hào)菌株出菇密度比較高；從成菇率方面分析秀珍菇5號(hào)和10號(hào)菌株較高；從菌蓋平展度方面分析，秀珍菇3號(hào)、10號(hào)和8號(hào)菌株整體菇型更秀美。綜合分析農(nóng)藝性狀，秀珍菇5號(hào)、3號(hào)菌株比較符合市場(chǎng)需求。

3 小結(jié)

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是鑒別食用菌菌株遺傳多樣性的常規(guī)方法，其具有非常高的多態(tài)性，使用的引物較長(zhǎng)、退火溫度較高，相對(duì)于SRAP、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，比較能夠準(zhǔn)確反映出菌株間的親緣關(guān)系，已廣泛應(yīng)用到秀珍菇、香菇、金針菇、銀耳等食用菌遺傳鑒定中。本試驗(yàn)利用ISSR引物對(duì)36個(gè)秀珍菇菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)秀珍菇菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍在0.66～1.00，將36個(gè)秀珍菇菌株聚為7個(gè)群，這表明秀珍菇遺傳差異較大，背景豐富。

表4 秀珍菇菌株栽培和商品性狀Tab.4 Cultivation and commercial characteristics of Pleurotus geesteranus strains

研究秀珍菇菌株的遺傳背景后，從不同類群中挑選出具有代表性的秀珍菇菌株進(jìn)行反季節(jié)設(shè)施栽培出菇試驗(yàn)，通過(guò)產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀等綜合數(shù)據(jù)分析后得出，5號(hào)菌株表現(xiàn)較為突出，產(chǎn)量比常規(guī)對(duì)照菌株高15.2%，并且在子實(shí)體色度、出菇密度、成菇率等性狀方面表現(xiàn)最好，符合市場(chǎng)需求?？梢?jiàn)，秀珍菇5號(hào)菌株為值得推廣的設(shè)施栽培菌株。