郭佳歡，馮會麗，史彥江，俞元春*

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院, 江蘇 南京 210037;2.新疆林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)林研究所, 新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】灰棗(Zizyphusjujubacv. ‘Huizao’)果實(shí)質(zhì)地密合、含水量低、糖分高、風(fēng)味佳，含有多種微量元素和較多的藥用成分，具有很高的食療價(jià)值和保健效果[1-3]，是優(yōu)質(zhì)的鮮食兼制干棗品種。新疆灰棗自20世紀(jì)70年代初從河南新鄭引種以來，當(dāng)?shù)氐锰飒?dú)厚的光熱資源使其各項(xiàng)經(jīng)濟(jì)性狀均優(yōu)于原產(chǎn)區(qū)，尤其在南疆各地得到大面積推廣，栽植面積達(dá)47.37×104hm2以上[4]，已成疆內(nèi)棗樹主栽品種[5]。然而，由于新疆特殊的地理位置及氣候條件，夏季晝夜溫差大，冬季長且寒冷，低溫凍害在灰棗的實(shí)際生產(chǎn)中時(shí)有發(fā)生，現(xiàn)已成為制約當(dāng)?shù)貤棶a(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。植物抗寒性是衡量植物本身對低溫冷害的承受能力的指標(biāo)，是決定植物分布與區(qū)劃的重要依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】目前，果樹抗寒性研究主要從細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、種質(zhì)資源及基因工程等多方面進(jìn)行研究[6-7]。其中，通過人工低溫處理測定植物體的相對電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量及脯氨酸含量[8]，并以此衡量植物的抗寒能力大小已成為目前常用的抗寒性評定方法[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于果樹抗寒性的研究已有大量報(bào)道，國內(nèi)外學(xué)者對于蘋果(Maluspumila)[10]、梨(Pyrusspp.)[11]、櫻桃(Cerasuspseudocerasus)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]、核桃(Juglansregia)[14]等果樹抗寒性都作過研究，但關(guān)于新選育的3個(gè)灰棗優(yōu)系抗寒性研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以普通灰棗和新疆林業(yè)科學(xué)院新選育的灰棗3個(gè)優(yōu)系為試驗(yàn)材料，通過人工低溫處理，對相對電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量及游離脯氨酸共5個(gè)抗寒性生理指標(biāo)進(jìn)行測定分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在探索灰棗優(yōu)系在低溫脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制，試圖探索灰棗及其優(yōu)系的抗寒機(jī)理，為灰棗耐寒品種的選育推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為灰棗和新疆林業(yè)科學(xué)院選育的3個(gè)灰棗優(yōu)系，目前暫命名為‘灰實(shí)2’、‘灰實(shí)7’和‘灰實(shí)8’。于2017年1月20日在阿克蘇實(shí)驗(yàn)林場二隊(duì)紅棗優(yōu)樹匯集圃選取長勢一致的1年生休眠二次枝為試驗(yàn)材料，灰棗和3個(gè)優(yōu)系各選取3株樣樹為重復(fù)，在東西南北4個(gè)方位各取5條枝，將同一品種/優(yōu)系樣品混合，帶回實(shí)驗(yàn)室。蒸餾水清洗3次，用吸水紙吸干多余水分并在枝條兩端封蠟后裝袋，貼標(biāo)簽，分組放入可控低溫冰箱內(nèi)冷凍待測。

1.2 試驗(yàn)方法

將灰棗及3個(gè)優(yōu)系的待測枝條剪成20 cm長的枝段，灰棗及每個(gè)優(yōu)系的枝段分成6組，取其中1組用于試驗(yàn)對照。將剪好的枝段用去離子水漂洗3次，用吸水紙吸干水分并在末端封蠟后分別置于可控低溫冰箱中進(jìn)行冷凍處理，每次處理時(shí)隨機(jī)選取灰棗和各優(yōu)系枝條5段，設(shè)3次重復(fù)，其余裝入自封袋中后放入0 ℃恒溫冰箱中保存待用。處理時(shí)，溫度梯度分別設(shè)為-15、-20、-25、-30、-35、-40 ℃，設(shè)-15 ℃為試驗(yàn)對照(CK)溫度。低溫處理時(shí)，在達(dá)到設(shè)定的冷凍溫度時(shí)需維持12 h，處理后將溫度上升至0 ℃，放置12 h后在室內(nèi)進(jìn)行各項(xiàng)抗寒指標(biāo)的測定。其中，溫度下降及上升的速度均為5 ℃/h。將灰棗和各優(yōu)系不同溫度處理的枝段切成2 mm厚的薄片，避開芽眼，同一品種/優(yōu)系薄片混合后待測。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 相對電導(dǎo)率 相對電導(dǎo)率(Relative electric conductivity, REC)采用電導(dǎo)率法[15]測定。稱取2 g切片試樣置于25 mL具塞試管中，加入去離子水至25 mL刻度線后蓋緊，放于搖床震蕩24 h，每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。采用上海京科雷磁公司生產(chǎn)的DDSL-308型電導(dǎo)率測定儀測定浸出液的初始電導(dǎo)率(C1)，將試管置于沸水中煮沸30 min，靜置冷卻后加去離子水定容至25 mL后測定其最終電導(dǎo)率(C2)，計(jì)算相對電導(dǎo)率。相對電導(dǎo)率按公式(1)計(jì)算：

REC=(C1/C2)×100 %

(1)

以處理溫度為橫坐標(biāo)，以相對電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)合Logistic方程(2)計(jì)算抗寒性[16]。

(2)

式中：Y為REC(%)，t為處理溫度( ℃)，由于本試驗(yàn)的植物細(xì)胞傷害率抵消了基礎(chǔ)干擾，因此設(shè)k=100，a，b為方程參數(shù)。通過對方程(2)線性化處理后得到方程式ln[(k-Y)/Y]=ln(a-bt)，Y=ln[(k-Y)/Y]。以處理溫度t為自變量，以相對電導(dǎo)率y為因變量，通過線性回歸后得到REC(Y)和處理溫度(t)的直線方程Y=at+b，并求得a，b值及相關(guān)系數(shù)R，運(yùn)用SPSS 18.0結(jié)合公式(2)可求得拐點(diǎn)處的值，即植物組織半致死溫度值LT50=-ln(a/b)。

通過對方程(2)求二階、三階導(dǎo)，并令其為0，則可得到棗樹細(xì)胞在低溫處理下開始受損時(shí)的起始溫度T1=(lna/3.732)/b和棗樹組織在低溫處理下完全致死的溫度T2=(lna/0.268)/b。

1.3.2 可溶性糖和可溶性蛋白 可溶性糖(Water soluble sugars, WSS)采用蒽酮比色法[17]測定。稱取0.3g切片試樣放入具塞試管，加入15 mL蒸餾水后放入水浴鍋內(nèi)煮沸20 min，取出冷卻后過濾至100 mL的容量瓶中，往試管中繼續(xù)加蒸餾水沖洗殘?jiān)鼣?shù)次過濾至容量瓶后定容至刻度線處。取1 mL提取液置于另一試管中，加入5 mL蒽酮試劑，搖勻，沸水浴10 min，冷卻后測定吸光度，比色波長為620 nm，重復(fù)3次，取平均值。測定時(shí)以蒸餾水為空白對照。WSS的計(jì)算公式(3)為：

(3)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)準(zhǔn)液可溶性糖含量(μg)，VT為提取液的總體積(mL)，WF為樣品鮮重(g)，VS為測定時(shí)的提取液取液量(mL)，n為稀釋倍數(shù)。

可溶性蛋白(Soluble protein, SP)采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[17]測定。稱取0.1 g切片試樣放入研缽，加入5 mL蒸餾水后研磨30 min。洗液轉(zhuǎn)移至離心管后置于4000 r/min的離心機(jī)中離心10 min。提取上清液，加蒸餾水定容至10 mL。取1 mL提取液加入小試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，靜置5 min。待反應(yīng)充分后測定吸光度，比色波長為595 nm，重復(fù)3次，取平均值。測定時(shí)以蒸餾水為空白對照。SP的計(jì)算公式(4)為：

(4)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)準(zhǔn)液可溶性蛋白含量(μg)，VT為提取液的總體積(mL)，VS測定時(shí)的提取液取液量(mL)，WF為樣品鮮重(g)。

1.3.3 丙二醛和游離脯氨酸 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[18]測定。取0.1 g切片試樣放入研缽，加入2 mL三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨至勻漿，再加入3 mL TCA進(jìn)一步研磨，將所得勻漿轉(zhuǎn)移至離心管后置于4000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，所得上清液即為提取液。取提取液測定吸光度，比色波長為532、600和450 nm，重復(fù)3次，取平均值。MDA含量的計(jì)算公式(5)為：

(5)

式中：MC為MDA含量(μmol/g)，MN為MDA濃度(μmol/L)，VT為提取液的總體積(mL)，WF為樣品鮮重(g)。其中，MN的計(jì)算方法為：MN=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450，OD532、OD600和OD450為在波長532、600和450 nm下的吸光度。

游離脯氨酸(Free proline, FP)采用茚三酮顯色法[19]測定。取0.3 g切片試樣放入具塞試管中，往試管中加入3 %的磺基水楊酸溶液5 mL，水浴加熱煮沸15 min，冷卻后提取上清液2 mL，加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑，水浴煮沸30 min。冷卻后加入4 mL甲苯，充分震蕩后靜置。取上層溶液測定吸光度，比色波長為520 nm，重復(fù)3次，取平均值。測定時(shí)以甲苯為空白對照。FP含量的計(jì)算公式(6)為：

(6)

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得標(biāo)準(zhǔn)液脯氨酸質(zhì)量(μg)，VT為提取液的總體積(mL)，VS測定時(shí)的提取液取液量(mL)，WF為樣品鮮重(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與作圖

將所測數(shù)據(jù)按照公式(7)以相對指標(biāo)為單位進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換，求得各理化指標(biāo)性狀的抗寒系數(shù)(Cold resistance coefficient, CRC)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。式中，VD為處理測定值，VC為對照測定值。

CRC=(VD/VC)×100 %

(7)

隸屬函數(shù)法[20]綜合各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行抗寒性評價(jià)，以公式(8)計(jì)算與抗寒性呈正相關(guān)的指標(biāo)(可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸)的隸屬度值；以公式(9)計(jì)算與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的指標(biāo)(丙二醛和相對電導(dǎo)率)的隸屬度值。

Uin=(Xin-Ximin)/(Ximax-Ximin)

(8)

(9)

按照平均隸屬度抗寒性分級法[21]將抗寒性分為5個(gè)級別，0.70～1.00為Ⅰ級，高抗(High resistance, HR)；0.60～0.69為Ⅱ級，抗(Resistance, R)；0.40～0.59為Ⅲ級，中抗(Middle resistance, MR)；0.30～0.39為Ⅳ級，低抗(Lower resistance, LR)；0～0.29為Ⅴ級，不抗。

表1 灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后REC多重比較

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列不同大小寫字母表示在0.01和0.05水平上差異顯著，下同。

Note:Values are means±SD. Different capital and small letters in a column indicate significant difference at 0.01 or 0.05 levels. The same as below.

采用EXCEL2007、ORIGIN PRO9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，采用SPSS18.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫處理對棗樹枝條REC的影響

電導(dǎo)率法是指植物受到低溫傷害時(shí)，細(xì)胞的膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)不同程度的滲出，導(dǎo)致電導(dǎo)率發(fā)生變化[22]。植物受凍越嚴(yán)重，外滲電解質(zhì)物質(zhì)越多，電導(dǎo)值越大，細(xì)胞膜受傷害程度越重，則植物抗寒性越差，反之，抗寒性越強(qiáng)[23]。由表1可以看出，灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8以及灰棗的相對電導(dǎo)率均隨著處理溫度的降低而升高，在相同溫度下的相對電導(dǎo)率差異明顯。當(dāng)處理溫度為初始值CK時(shí)，灰實(shí)8的相對電導(dǎo)率最低，為37.44 %，極顯著(P<0.01)低于灰實(shí)2和灰棗，顯著(P<0.05)低于灰實(shí)7。當(dāng)處理溫度為-20 ℃時(shí)，與對照溫度相比，灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8以及灰棗的相對電導(dǎo)率上升幅度較小，分別為12.72 %、6.86 %、9.67 %和8.21 %，說明此時(shí)溫度下降對灰棗及其優(yōu)系的影響相對較小。當(dāng)處理溫度降至-25 ℃時(shí)，灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8以及灰棗的相對電導(dǎo)率大幅上升，其上升幅度分別為46.15 %、33.01 %、32.59 %、41.52 %，除灰實(shí)8外，其余品種/優(yōu)系的相對電導(dǎo)率均超過了50 %，說明在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)大量外滲，灰棗及其優(yōu)系受凍明顯。當(dāng)處理溫度降至-30 ℃及以下時(shí)，不同品種(系)棗樹相對電導(dǎo)率均已超過65 %，且變化幅度較小，說明-30 ℃及以下時(shí)灰棗及其優(yōu)系會遭到嚴(yán)重凍害。

從表2可以看出，灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后的抗寒性有所差異?；覍?shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8和灰棗的組織細(xì)胞初始凍傷溫度分別為-3.08、-2.36、-2.49和-2.89 ℃，低溫半致死溫度分別為-11.48、-8.82、-9.30和-10.80 ℃，以及組織細(xì)胞接近全透時(shí)的低溫完全致死溫度分別為-42.85、-32.89、-34.69和-40.31 ℃。以半致死溫度的高低作為衡量棗樹抗寒性能大小的標(biāo)準(zhǔn)，其排序?yàn)榛覍?shí)2>灰棗>灰實(shí)8>灰實(shí)7。

2.2 不同低溫處理對棗樹枝條WSS和SP含量的影響

可溶性糖對于植物抗寒的生理機(jī)制主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透液濃度，降低水勢，提升細(xì)胞保水效果，從而降低冰點(diǎn)，同時(shí)可溶性糖對植物細(xì)胞原生質(zhì)體，線粒體等細(xì)胞器及膜上敏感偶聯(lián)因子起到保護(hù)作用。由表3可知，不同低溫處理后，不同棗樹枝條可溶性糖含量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，且可溶性糖含量達(dá)到峰值時(shí)的處理溫度值基本相同，灰棗各優(yōu)系及灰棗均在-30 ℃時(shí)的可溶性糖測定含量達(dá)到最大值。其中，灰實(shí)2與灰棗對照組差異不明顯，灰實(shí)7與灰棗對照組呈顯著差異(P<0.05)，灰實(shí)8與對灰棗照組成極顯著差異(P<0.01，表3)。

表2 灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后的半致死溫度

表3灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后WSS多重比較

Table 3 Multiple comparison of water soluble sugars from different excellent strains ofZiziphusjujuba‘Huizao’ under low temperature ( %)

品種(系)Variety (Clones)可溶性糖(%) Water soluble sugars CK-20 ℃-25 ℃-30 ℃- ℃-40 ℃灰實(shí)2Gray experiment 22.41±0.17Bc2.58±0.11Bb4.96±0.19ABb6.76±0.13Bbc5.56±0.15Bb4.75±0.08Ab灰實(shí)7Gray experiment 72.68±0.12Bb2.77±0.07Bb5.01±0.13ABab6.98±0.14Bb5.78±0.08Bb4.89±0.15Aab灰實(shí)8Gray experiment 83.15±0.08Aa3.42±0.15Aa5.22±0.04Aa7.32±0.10Aa6.23±0.21Aa5.08±0.13Aa灰棗Ziziphusjujuba ‘Huizao’2.53±0.12Bbc2.67±0.12Bb4.71±0.08Bc6.69±0.10Bc5.67±0.02Bb4.72±0.19Ab

由表4可知，低溫條件下，可溶性蛋白含量在灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8及灰棗上呈現(xiàn)“低-高-低”的變化趨勢，且均在-25 ℃附近時(shí)測定含量達(dá)到最大值。當(dāng)處理溫度為初始值CK時(shí)，灰實(shí)8的可溶性蛋白含量極顯著高于灰實(shí)2、灰實(shí)7和灰棗(P<0.01)，灰實(shí)2、灰實(shí)7和灰棗間并無明顯差異；當(dāng)處理溫度達(dá)到-25 ℃時(shí)，灰實(shí)7和灰實(shí)8的可溶性蛋白測定含量與灰實(shí)2和灰棗呈極顯著差異，灰實(shí)2的可溶性蛋白含量與對灰棗對照組基本一致。

2.3 不同低溫處理對棗樹枝條MDA和FP含量的影響

從表5可以看出，隨著處理溫度的降低，不同品種/優(yōu)系棗樹枝條測得的丙二醛含量呈現(xiàn)“低-高-低-高”波浪式變化趨勢。灰實(shí)2和灰棗在-35 ℃時(shí)達(dá)到最高值，達(dá)11 μmol/g以上，且與灰實(shí)7、灰實(shí)8存在極顯著差異(P<0.01)；灰實(shí)7和灰實(shí)8在-40 ℃時(shí)達(dá)到最高值，為10.42～10.71 μmol/g左右，灰實(shí)8與灰實(shí)2呈顯著差異(P<0.05)。

正常條件下，植物細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量很低，但遇到逆境脅迫時(shí)，游離脯氨酸變化積累，并且積累值指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。由表6可以看出，低溫處理過程中，灰實(shí)7和灰實(shí)8的游離脯氨酸含量變化幅度較大，波動(dòng)范圍達(dá)到3.89～3.93 mg/g；灰實(shí)2和灰棗的變化較小，波動(dòng)范圍為3.22～3.31 mg/g。當(dāng)處理溫度為初始對照溫度CK時(shí)，灰實(shí)2和灰實(shí)8的與灰棗呈顯著差異(P<0.05)，灰實(shí)7與灰棗呈極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)處理溫度降至-25 ℃時(shí)，灰棗及其優(yōu)系的游離脯氨酸含量均達(dá)到最大值，其中灰實(shí)7與灰棗呈顯著差異(P<0.05)，灰實(shí)8與灰棗呈極顯著差異(P<0.01)，灰實(shí)2與灰棗的差異不顯著。當(dāng)處理溫度為-30 ℃時(shí)開始明顯下降，至-35 ℃時(shí)有所上升，之后開始下降，整體來看，低溫處理下灰棗及其優(yōu)系的游離脯氨酸含量變化表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢。

表4 灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后SP多重比較

表5 灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后MDA多重比較

2.4 抗寒指標(biāo)間的相關(guān)性分析

從表7可以看出，不同抗寒性指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性。其中，可溶性糖與相對電導(dǎo)率(r=0.625)呈極顯著正相關(guān)；可溶性蛋白與丙二醛(r=-0.524)、相對電導(dǎo)率(r=-0.540)呈極顯著負(fù)相關(guān)。丙二醛與游離脯氨酸(r=0.522)、相對電導(dǎo)率(r=0.699)呈極顯著正相關(guān)；游離脯氨酸與相對電導(dǎo)率(r=0.280)呈顯著正相關(guān)；其余各抗寒性指標(biāo)間雖有相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)較低，相關(guān)性不顯著。

表6 灰棗不同優(yōu)系在低溫處理后FP多重比較

表7 各抗寒性指標(biāo)間的相關(guān)性分析

注：*表示5 %顯著水平；**表示1 %極顯著水平,下同。

Note: * Correlation is significant at the 5 % level; **Correlation is significant at the 1 % level. The same as below.

表8 灰棗不同優(yōu)系的抗寒性綜合評判

2.5 抗寒性綜合評價(jià)

植物的抗寒生理機(jī)制是由多種因素綜合作用的結(jié)果，只有結(jié)合多個(gè)抗寒指標(biāo)才能真正反映植物的抗寒能力。為了更準(zhǔn)確的評價(jià)灰棗優(yōu)系的抗寒性，本研究采用隸屬函數(shù)法，綜合REC、WSS、SP、MDA、FP等多種抗寒因子，用平均隸屬度對灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8及灰棗的抗寒能力進(jìn)行綜合評價(jià)。平均隸屬度值越高，說明其抗寒能力越強(qiáng)，反之抗寒能力越弱。研究結(jié)果顯示，灰棗及其優(yōu)系的抗寒因子綜合隸屬度在0.456～0.482之間，灰實(shí)2的平均隸屬度最高(0.482)，灰實(shí)7最低(0.456)。綜合結(jié)果表明，灰棗及其優(yōu)系的抗寒性綜合排序?yàn)椋夯覍?shí)2>灰棗>灰實(shí)8>灰實(shí)7(表8)。

3 討 論

3.1 相對電導(dǎo)率與抗寒性的關(guān)系分析

低溫處理過程中，溫度越低，灰棗及其優(yōu)系的枝條組織的電解質(zhì)外滲量越大，相對電導(dǎo)率增幅越明顯。研究顯示，人為低溫處理后，灰棗及其優(yōu)系枝條組織的電解質(zhì)外滲率隨溫度下降而表現(xiàn)出急劇上升的變化趨勢。Jan[24]認(rèn)為，低溫傷害使植物細(xì)胞的膜脂流動(dòng)性及細(xì)胞的膜透性增加，細(xì)胞液外滲導(dǎo)致待測溶液電解質(zhì)增加，最終導(dǎo)致電導(dǎo)率增大。本試驗(yàn)結(jié)果與Jan對于低溫脅迫傷害對植物生理機(jī)制的影響研究相同。單以灰棗及其優(yōu)系組織細(xì)胞接近全透時(shí)的低溫完全致死溫度作為衡量棗樹抗寒性能大小的標(biāo)準(zhǔn)，灰實(shí)2的抗寒性能明顯優(yōu)于灰棗、灰實(shí)8、灰實(shí)7。

3.2 各抗寒性生理指標(biāo)間的關(guān)系分析

可溶性糖是調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)部滲透勢、降低水勢的主要因子之一，通常條件下，植物體內(nèi)可溶性糖的含量增加表明植物抗寒性的增強(qiáng)。研究結(jié)果顯示，低溫處理過程中，灰棗及其優(yōu)系的可溶性糖含量呈現(xiàn)出先升后降的“n”型單峰曲線，且達(dá)到峰值時(shí)的處理溫度均在-30 ℃之間。其中，灰實(shí)8在-30 ℃時(shí)的可溶性糖含量極顯著高于灰實(shí)2、灰實(shí)7和灰棗。Sakai[25]認(rèn)為植物組織細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的含量較高則代表該植物抗寒性較好，本研究對灰棗及其優(yōu)系的抗寒性能綜合評價(jià)結(jié)果顯示這與Sakai的研究結(jié)論一致。

低溫脅迫對植物細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響變化主要表現(xiàn)在可溶性蛋白和酶類的變化以及產(chǎn)生抗寒性蛋白?？扇苄缘鞍拙哂休^強(qiáng)的親水性，它能明顯增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，而植物細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量的增加可以束縛更多的自由水，減少胞內(nèi)自由水因低溫結(jié)冰膨脹而對原生質(zhì)體造成的傷害，從而提高植物的抗寒性。本研究結(jié)果顯示，低溫處理過程中，灰棗及其優(yōu)系的可溶性蛋白含量變化規(guī)律明顯，表現(xiàn)出一致的變化趨勢，均在-25 ℃附近時(shí)測定含量達(dá)到最大值。這與玉蘇甫等[26]對梨砧木抗寒性的研究結(jié)果相似。

在低溫逆境下植物遭受傷害與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)。丙二醛是膜脂過氧化過程中活性氧簇(ROS, Reactive oxygen species與生物膜上的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成過氧化最終產(chǎn)物。丙二醛對質(zhì)膜有毒害作用，膜透性直接反映細(xì)胞的損傷程度[27]。因此，低溫處理時(shí)，丙二醛含量變化通常作為衡量植物抗寒能力的一個(gè)重要生理指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，不同棗樹優(yōu)系枝條測得的丙二醛含量呈“低-高-低-高”波浪式變化，抗寒性強(qiáng)的灰棗優(yōu)系丙二醛含量上升較早，下降也較早。其中，灰實(shí)2和灰棗在-35 ℃時(shí)最高值達(dá)到11 μmol/g以上，灰實(shí)7和灰實(shí)8在-40 ℃時(shí)最高值為10.42～10.71μmol/g。這說明，抗寒性較強(qiáng)的優(yōu)系以通過減少丙二醛的滯留時(shí)間來減少因低溫脅迫引起的丙二醛積累對植物細(xì)胞造成的傷害。

游離脯氨酸由于其極強(qiáng)的親水性，能夠調(diào)節(jié)滲透勢，穩(wěn)定原生質(zhì)體及組織的代謝過程，因而能提高滲透壓，降低冰點(diǎn)，增強(qiáng)植物抗寒性。本研究結(jié)果顯示，灰實(shí)7和灰實(shí)8的游離脯氨酸含量波動(dòng)范圍較大，為3.89～3.93 mg/g；灰實(shí)2和灰棗的波動(dòng)范圍較小，為3.22～3.31 mg/g。當(dāng)溫度降至-25 ℃時(shí)，灰棗及其優(yōu)系的游離脯氨酸含量均達(dá)到最大值，當(dāng)處理溫度為-30 ℃時(shí)開始明顯下降，至-35 ℃時(shí)有所上升，之后開始下降。以游離脯氨酸的含量變化作為衡量植物抗寒性能力的標(biāo)準(zhǔn)，灰實(shí)2和灰棗的抗寒性較好，灰實(shí)7和灰實(shí)8的抗寒性較差。

低溫脅迫可對植物細(xì)胞內(nèi)相對電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量及脯氨酸含量等多項(xiàng)生理指標(biāo)產(chǎn)生影響，而這些生理指標(biāo)正好也反映了植物的抗寒性能。綜合研究說明，不同抗寒性指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性?？扇苄蕴桥c丙二醛、相對電導(dǎo)率呈正相關(guān)，可溶性糖與相對電導(dǎo)率呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)(r=0.625)，與可溶性蛋白、游離脯氨酸呈負(fù)相關(guān)?？扇苄缘鞍着c游離脯氨酸呈正相關(guān)，與丙二醛(r=-0.524)、相對電導(dǎo)率(r=-0.540)呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)。丙二醛與游離脯氨酸(r=0.522)、相對電導(dǎo)率(r=0.699)呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。游離脯氨酸與相對電導(dǎo)率呈顯著(P<0.05)正相關(guān)。其余各抗寒性指標(biāo)間雖有相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)較低，相關(guān)性不顯著?；覍?shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8和灰棗的綜合隸屬度在0.40～0.59之間，分別為0.482、0.478、0.456和0.476。

4 結(jié) 論

按照平均隸屬度抗寒性分級法對灰棗及其優(yōu)系抗寒性分級：灰實(shí)2、灰實(shí)7、灰實(shí)8和灰棗的抗寒性均為Ⅲ級，抗寒能力為中抗，其抗寒性能力大小綜合排序?yàn)椋夯覍?shí)2>灰棗>灰實(shí)8>灰實(shí)7，其中推薦灰實(shí)2作為抗寒性優(yōu)良品種。