郭永翠，朱 玲，高 山，張建良，張 銳,2*

(1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300; 2.塔里木大學(xué)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 阿拉爾 843300; 3.新疆伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 新疆 伊寧 835000; 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師三團(tuán), 新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】核桃(JuglansregiaL.)在中國(guó)栽培歷史悠久，因其富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等人體所必需物質(zhì)及鐵、鋅、錳等多種微量元素，對(duì)于延緩人體衰老、心血管的保健作用、預(yù)防慢性疾病等具有非凡意義，有著極佳的保健效果和藥用價(jià)值，在國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)均具有巨大的消費(fèi)潛力[1-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】新疆核桃殼薄、早實(shí)豐產(chǎn)、出仁率高且種仁飽滿，其中紙皮核桃品質(zhì)尤為突出，成為近年成為消費(fèi)熱點(diǎn)[5]。‘紙皮’核桃殼厚小于1.0 mm (大多在0.5 ～0.8 mm)，出仁率達(dá)65.0 %以上，種仁飽滿，內(nèi)果皮發(fā)育完整，其中‘溫138’核桃是‘紙皮’核桃栽培園中發(fā)現(xiàn)的突變株，其平均出仁率高達(dá)83.2 %，產(chǎn)量極高，果殼極薄、極易脫皮，但殼面(內(nèi)果皮發(fā)育不完整)開(kāi)裂導(dǎo)致露仁，是適于核桃深加工的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源[6-7]。木質(zhì)素(lignin)是核桃內(nèi)果皮(硬殼)的主要成分且是內(nèi)果皮中難分解的大分子有機(jī)物質(zhì)，其沉積出現(xiàn)在次生加厚的細(xì)胞壁中以提高細(xì)胞壁的強(qiáng)度及硬度，對(duì)核桃內(nèi)果皮發(fā)育影響較大[8-9]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，簡(jiǎn)稱PAL)存在于一些菌類、藻類及所有綠色植物中，是參與木質(zhì)素生物合成過(guò)程中苯丙烷類代謝途徑的首個(gè)關(guān)鍵酶，在多種植物的木質(zhì)化組織中含有較高PAL活性，PAL基因?qū)δ举|(zhì)素的合成起重要作用[10-11]。目前已從辣椒(CapsicumannuumL.)[12]、當(dāng)歸(Angelicasinensis)[13]、馬尾松(Pinusmassoniana)[14]、黃瓜(CucumissativusL.)[15]等多種植物中成功獲得了PAL基因并展開(kāi)相關(guān)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物中PAL基因?qū)δ举|(zhì)素的合成起重要作用，在轉(zhuǎn)基因煙草(NicotianatabacumL.)植株中抑制PAL的表達(dá)將導(dǎo)致木質(zhì)素等相關(guān)次生代謝產(chǎn)物含量的下降，但植株生長(zhǎng)出現(xiàn)不正常現(xiàn)象[16]。不同PAL基因在擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株中各個(gè)部位的表達(dá)量不同，表明不同的PAL基因具有不同生物活性和表達(dá)部位[17]；其在不同品種龍眼(EuphorialonganL.)葉片中的表達(dá)量存在顯著差異[18]；且在獨(dú)一味(Lamiophlomisrotata)的不同組織中表達(dá)有差異，表達(dá)量由高到低分別是葉片、根部、葉柄、莖[19]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前關(guān)于‘溫138’核桃露仁現(xiàn)象及其與之相關(guān)的核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程中木質(zhì)素沉積的系統(tǒng)分子機(jī)理尚不明確，本研究以‘溫138’、‘紙皮’核桃為研究對(duì)象，對(duì)其內(nèi)果皮中木質(zhì)素相關(guān)PAL基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，為運(yùn)用基因工程改良核桃果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料露仁種質(zhì)‘溫138’核桃及硬殼發(fā)育完整‘紙皮’核桃，均采自新疆維吾爾自治區(qū)溫宿縣核桃木本糧油林場(chǎng)(圖1)。在果實(shí)膨大期后期6月7日(約花后51 d)至硬核期7月26日(約花后100 d)采樣，采樣覆蓋整個(gè)核桃內(nèi)果皮硬化期。將核桃內(nèi)果皮剝離存于-80 ℃超低溫冰箱中。

植物總RNA提取采用E.Z.N.A Plant RNA特殊植物RNA提取試劑盒(Omega公司)；cDNA第一鏈合成采用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(100rxns)試劑盒(全式金公司)；膠回收采用Easy Pure?Quick Gel Extraction試劑盒(全式金公司)；qRT-PCR檢測(cè)采用SYBR?Premix ExTaqTMGC(Perfect Real Time染料法)試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 核桃內(nèi)果皮總RNA提取

利用植物總RNA提取試劑盒提取核桃內(nèi)果皮中總RNA。用1 %瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)及鑒定PCR產(chǎn)物的濃度、純度和亮度。采用cNDA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表的核桃PAL基因序列(登錄號(hào)：JX069977.1)設(shè)計(jì)引物，‘溫138’核桃引物PAL-F1：5′-CCCCTCCAAACAACCCAA-3′及PAL-R1：5′-CCTTCAGACAATCCAGCA-3′，‘紙皮’核桃引物PAL-F2：5′-ACCCAATCCAAGAAAGAA-3′及PAL-R1：5′-CCTTCAGACAATCCAGCA-3′。引物由上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

A:‘溫138’核桃硬殼發(fā)育情況, B: ‘紙皮’核桃硬殼發(fā)育情況A: ‘Wen138’ walnuts shell development, B: ‘Zhipi’ walnuts shell development圖1 ‘溫138’和‘紙皮’核桃硬殼發(fā)育情況Fig.1 ‘Wen138’ walnuts and ‘Zhipi’ walnuts shell development

1.4 核桃內(nèi)果皮PAL基因的克隆及測(cè)序

RT-PCR反應(yīng)體系(20 μl)及條件為：模板3 μl，上、下游引物(10 μM)各0.5 μl，2×EasyTaq?PCR SuperMix 10 μl，最后加滅菌ddH2O6μl。擴(kuò)增條件：94 ℃/3 min(預(yù)變性)；94 ℃/45 s(變性)，57 ℃/45 s(退火)，72 ℃/2 min(延伸)，31個(gè)循環(huán)；72 ℃/8 min(繼續(xù)延伸)；4 ℃保存。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并成像，后將擴(kuò)增的目的條帶進(jìn)行回收并連接到T載體，篩選出陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 核苷酸、氨基酸序列分析 將陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果及推導(dǎo)氨基酸序列采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行在線PAL序列匹配度、同源性分析；ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)檢測(cè)cDNA序列的開(kāi)放閱讀框；PAL基因推導(dǎo)氨基酸序列采用Clustal X 1.08軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；PAL蛋白功能結(jié)構(gòu)域利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行在線分析。

1.5.2 理化性質(zhì)分析 運(yùn)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)ProtParam功能(http://web.expasy.org/protparam/)分析核桃內(nèi)果皮WJ-PAL蛋白及ZJ-PAL蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸數(shù)量及理論等電點(diǎn)等相關(guān)理化性質(zhì)。

1.5.3 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 運(yùn)用EBI數(shù)據(jù)庫(kù)InterProScan功能(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)在線分析及預(yù)測(cè)核桃內(nèi)果皮PAL蛋白保守區(qū)域、采用PredictProtein在線平臺(tái)(https://www.predictprotein.org/)分析PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，選用在線同源服務(wù)軟件SWISS-MODEL (http://swissmo del.expasy.org/)預(yù)測(cè)PAL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.5.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹 采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST在線比對(duì)，選取與克隆基因相似性較高的植物，采用MAGA5.1軟件(Neighbor-Joining法)構(gòu)建PAL基因與其它相似性高植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 PAL基因的表達(dá)分析

以18S為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)PAL基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)已克隆的核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素PAL基因序列，按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物原則，分別設(shè)計(jì)‘溫138’、‘紙皮’核桃PAL基因熒光定量PCR引物，露仁種質(zhì)‘溫138’核桃PCR引物PAL-WF：5′-AGGTGAAACGCATGGTGG-3′，PAL-WR：5′-CCTGTGATATGGTCAGGGTCTT-3′，硬殼完整種質(zhì)‘紙皮’核桃PCR引物PAL-ZF：5′-CCGTTGTTGACGCTGTTTAT-3′，PAL-ZR：5′-GGGAG ACCCTGACCATTTC-3′，內(nèi)參基因引物：NBQ-F：5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3′；NBQ-R: 5′-GCTGGGCAGGTATCGACAAT-3′。以‘溫138’及‘紙皮’核桃8個(gè)時(shí)期的cDNA為模板，采用兩步法進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl，正、反引物(10 μM)各0.2 μl，SYBR?Premix ExTaqTMGC5 μl，最后加滅菌ddH2O至10 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃/30 s，95 ℃/5 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線生成步驟：58 ℃/30 s，72 ℃/30 s，95 ℃/15 s，55 ℃/15 s；55 ℃/20 min；95 ℃/15 s。利用2-△△Ct方法[20]分別計(jì)算PAL基因在硬殼完整和露仁核桃內(nèi)果皮發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)

核桃內(nèi)果皮中總RNA凝膠成像呈現(xiàn)較清晰完整的28S rRNA和18S rRNA條帶，5S rRNA條帶較模糊，表明所得的總RNA有較好的完整性，28S rRNA的亮度是18S rRNA的兩倍，測(cè)得核酸濃度A260/A280為1. 90～2. 20，說(shuō)明提取的總RNA有較高的純度(圖2)。

2.2 核桃內(nèi)果皮PAL基因的克隆

以‘溫138’和‘紙皮’核桃內(nèi)果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，通過(guò)所設(shè)計(jì)的引物(PAL-F1、PAL-R1和PAL-F2、PAL-R1)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(圖3)，得到露仁及硬殼完整核桃PAL基因序列，分別命名為WJ-PAL和ZJ-PAL(圖4)。WJ-PAL基因片段長(zhǎng)度為1000 bp (含有600 bp的ORF)，可編碼200個(gè)氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其分子量為21.11 kD，理論等電點(diǎn)為8.44，WJ-PAL屬于堿性蛋白；ZL-PAL基因片段長(zhǎng)度為1000 bp (含有690 bp的ORF)，可編碼230個(gè)氨基酸，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其分子量為24.10 kD，理論等電點(diǎn)為7.44，ZJ-PAL屬于弱堿性蛋白。

圖2 電泳檢測(cè)核桃內(nèi)果皮總RNAFig.2 Electrophoresis of total RNA from walnut endocarp

M: DL2000 DNA Marker; 1: ‘溫138’核桃; 2: ‘紙皮’核桃M: DL2000 DNA Marker; 1: ‘Wen138’ walnut; 2: ‘Zhipi’ walnut圖3 核桃內(nèi)果皮PAL基因的保守區(qū)PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR product of PAL gene conservative region in walnut endocarp

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 序列分析 將得到的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)己知植物PAL基因進(jìn)行序列同源性比對(duì)的結(jié)果(圖5)表明，WJ-PAL與ZJ-PAL核苷酸序列及氨基酸推導(dǎo)序列均與其它植物PAL基因序列有較高的匹配度。

將本研究獲得的2個(gè)基因進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示W(wǎng)J-PAL和ZJ-PAL核苷酸序列與黑核桃、桃、日本杏等物種的PAL基因序列匹配度最高，其同源性均可達(dá)到77 %～96 %，其中均與黑核桃(AJ278454.1)的匹配度最高，WJ-PAL、ZJ-PAL與黑核桃同源性分別達(dá)到89 %、96 %。其相似性經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTp在線分析可知，WJ-PAL和ZL-PAL

與其它植物推導(dǎo)氨基酸序列相似性均在79 %以上。PAL推導(dǎo)氨基酸序列發(fā)現(xiàn)WJ-PAL與ZL-PAL均存在Phenylalanine ammonia-lyase and histidine ammonia-lyase (PAL-HAL)、PPK09367、huth及HutH 4個(gè)非特異性位點(diǎn)，并且含有phe_am_lyase、芳香族裂解酶的Lyase_aromatic及PAL (PLN02457) 3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，WJ-PAL與ZL-PAL為多結(jié)構(gòu)域蛋白，屬于裂解酶I (Lyase_I_Like)超家族(圖5)。

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將本研究獲得的兩個(gè)基因核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖6)，露仁種質(zhì)‘溫138’克隆所得WJ-PAL基因和硬殼完整品種‘紙皮’克隆所得ZJ-PAL基因序列一致性顯示只有54.76 %。

經(jīng)過(guò)在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)核桃WJ-PAL及ZJ-PAL基因與其它植物的PAL基因具有較高的相似性，選取與WJ-PAL及ZJ-PAL相似性較高的十九種植物構(gòu)建核桃PAL基因與其它植物PAL基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)。結(jié)果顯示，核桃與喬木類植物親緣關(guān)系較近，‘紙皮’核桃與黑核桃聚為一支，川楊、顫楊、胡楊、毛果楊等楊樹較好的聚為一支，鹽膚木與芒果這兩個(gè)漆樹科植物聚為同一支，蕓香科柑橘屬的檸檬與甜橙聚為同一支，葡萄科的葡萄與桑科的桑樹較好的聚為一支，并且自展值均達(dá)到100，其它植物也各自與相近的植物聚為一支。硬殼完整核桃‘紙皮’(ZJ-PAL)與黑核桃(Juglansnigra)聚在一起，卻與露仁核桃種質(zhì)‘溫138’ (WJ-PAL)未能聚為同一支，這說(shuō)明就PAL基因而言，硬殼完整核桃‘紙皮’與黑核桃聚為一支說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，而露仁種質(zhì)‘溫138’核桃卻未與黑核桃及其它同源植物聚在一起說(shuō)明有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

A: WJ-PAL基因片段測(cè)序; B: ZJ-PAL基因片段測(cè)序A: Sequencing result of WJ-PAL gene fragment; B: Sequencing result of ZJ-PAL gene fragment圖4 核桃PAL基因片段測(cè)序Fig.4 Sequencing result of PAL gene fragment in walnut

A: WJ-PAL基因的結(jié)構(gòu)域分析; B: ZJ-PAL基因的結(jié)構(gòu)域分析A: Domain analysis of WJ-PAL gene; B: Domain analysis of ZJ-PAL gene圖5 PAL基因的結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Domain analysis of PAL gene

圖6 WJ-PAL及ZJ-PAL基因多重序列比對(duì)Fig.6 Multiple sequence alignment of WJ-PAL and ZJ-PAL gene

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

提交WJ-PAL、ZJ-PAL蛋白的氨基酸序列進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析(圖8)。分析得到，WJ-PAL蛋白含有58.29 %的無(wú)規(guī)則卷曲，是WJ-PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件，其次含有35.68 %的α-螺旋和6.02 %的延伸鏈等結(jié)構(gòu)元件，N-末端存在較多的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而C-末端則存在較多的延伸鏈結(jié)構(gòu)。ZJ-PAL蛋白主要含有48.03 %的α-螺旋，是ZJ-PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中最為重要的結(jié)構(gòu)元件，其次含有46.03 %的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和5.68 %的延伸鏈。

在線預(yù)測(cè)WJ-PAL和ZJ-PAL蛋白的保守區(qū)域，結(jié)果表明這兩個(gè)蛋白屬于L-天冬氨酸家族(L-Aspartase-like)，WJ-PAL和ZJ-PAL蛋白保守區(qū)域包含芳香族氨基酸裂解酶(IPR001106)活性位點(diǎn)。其中ZJ-PAL蛋白具有PAL-HAL信號(hào)(含有PAL-HAL活性位點(diǎn))，具備苯丙氨酸解氨酶(PAL)家族蛋白的特征。

圖7 核桃與18種植物PAL基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree of PAL gene in walnut and 18 other plants

A: WJ-PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu); B: ZJ-PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu); 紅色:α-螺旋; 藍(lán)色:延伸鏈A: Secondary structure of WJ-PAL protein; B: Secondary structure of ZJ-PAL protein; Red: α-helix; Blue: Extended strand圖8 PAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of 7 PAL protein

A: WJ-PAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu); B: ZJ-PAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)A:The tertiary structure of WJ-PAL protein; B: The tertiary structure of ZJ-PAL protein圖9 PAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 The tertiary structure of PAL protein

A:WJ-PAL基因相對(duì)表達(dá)量; B: ZJ-PAL基因相對(duì)表達(dá)量; W: ‘溫138’核桃; Z:‘紙皮’核桃; W(Z)67: 花后51 d (6月7日); W(Z)613: 花后57 d (6月13日); W(Z)621: 花后65 d (6月21日); W(Z)628: 花后72 d (6月28日); W(Z)74: 花后78 d (7月4日); W(Z)712: 花后86 d (7月12日); W(Z)720: 花后94 d (7月20日); W(Z)726: 花后100 d (7月26日)A: Relative expression of WJ-PAL gene; B: Relative expression of ZJ-PAL gene; W: ‘Wen 138’ walnut; Z: ‘Zhipi’ walnut; W (Z) 67: 51 days after anthesis (June 7th); W (Z) 613: 57 days after anthesis (June 13th); W (Z) 621: 65 days after anthesis (June 21st); W (Z) 628: 72 days after anthesis (June 28th); W (Z) 74: 78 days after anthesis (July 4th); W (Z) 712: 86 days after anthesis (July 12th); W (Z) 720: 94 days after anthesis (July 20th); W (Z) 726: 100 days after anthesis (July 26th)圖10 核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程PAL基因相對(duì)表達(dá)水平Fig.10 Relative expression level of PAL gene during hardening of walnut endocarp

2.5 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

分別建立WJ-PAL與ZJ-PAL蛋白三維空間結(jié)構(gòu)模型(圖9)。WJ-PAL與ZJ-PAL這兩種蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中均α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)元件，其它元件較少。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知ZJ-PAL較WJ-PAL結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多，其α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)等元件含量多。

2.6 WJ-PAL與ZJ-PAL基因相對(duì)定量分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析WJ-PAL與ZJ-PAL在核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程中的表達(dá)水平(圖10)。WJ-PAL基因相對(duì)表達(dá)量在‘溫138’核桃的8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期中有非常明顯的差異。相對(duì)表達(dá)量最高的花后100 d (117.78)是相對(duì)表達(dá)量最低的花后51 d (1.00)的117倍。這表明，‘溫138’核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程的前期PAL基因表達(dá)量相對(duì)較小，至核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程的后期其PAL基因大量表達(dá)。在核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程的8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期ZJ-PAL基因的相對(duì)表達(dá)量相較WJ-PAL差異較小，在這8個(gè)時(shí)期中，相對(duì)表達(dá)量最高的花后65 d (1.33)是相對(duì)表達(dá)量最低的花后72 d (0.25)的5倍。PAL基因在露仁核桃‘溫138’內(nèi)果皮中前期木質(zhì)素相對(duì)表達(dá)量均較低，于花后86 d開(kāi)始增長(zhǎng)，在花后100 d達(dá)到最高值，是前期的近100倍，硬殼完整核桃‘紙皮’在硬核期整個(gè)時(shí)期木質(zhì)素相對(duì)表達(dá)量變化較平緩，于花后72 d最低，最高出現(xiàn)在花后65 d，整個(gè)種皮發(fā)育過(guò)程中，PAL基因在硬殼完整核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量低于同期露仁核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量。

3 討 論

PAL能夠催化高等植物中苯丙氨酸解氨生成氨氣和反式肉桂酸，是木質(zhì)素單體合成過(guò)程中所需的第一步反應(yīng)酶[21]，其受環(huán)境影響較小可用作物種鑒定[22]。目前關(guān)于露仁核桃在PAL基因克隆及表達(dá)分析方面研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，PAL對(duì)核桃露仁現(xiàn)象的作用機(jī)理還不得而知。本試驗(yàn)克隆得到露仁核桃種質(zhì)‘溫138’及硬殼發(fā)育完整核桃種質(zhì)‘紙皮’內(nèi)果皮PAL基因，分別命名為WJ-PAL與ZJ-PAL，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)獲得PAL基因的理化性質(zhì)參數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等，分析PAL基因的進(jìn)化關(guān)系及在核桃內(nèi)果皮硬化過(guò)程中不同時(shí)期中的相對(duì)表達(dá)特性。

WJ-PAL與ZJ-PAL基因均為苯丙氨酸解氨酶基因的家族成員，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得知，WJ-PAL與ZJ-PAL推導(dǎo)氨基酸序列存在相同的非特異性位點(diǎn)(PPK09367, HutH, hutH及PAL-HAL)及功能結(jié)構(gòu)域(PLN02457, phe_am_lyase及Lyase_aromatic)，這一結(jié)果白樺(Betulaplatyphylla)、美洲南瓜(Cucurbitapepo)相關(guān)研究結(jié)果吻合[11, 23]。同源性分析顯示核桃露仁種質(zhì)WJ-PAL基因與其它植物沒(méi)有聚為一支，而硬殼發(fā)育完整ZJ-PAL基因與同科的植物較好地聚在一起，其與喬木類植物親緣關(guān)系較近，其中與黑核桃親緣性最高。WJ-PAL與ZJ-PAL核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列與黑核桃PAL基因及其氨基酸序列的相似性分別為89 %和99 %。發(fā)現(xiàn)不同植物間PAL基因也有較高的一致性，推測(cè)PAL在核桃發(fā)育過(guò)程中對(duì)內(nèi)果皮(硬殼)完整程度有較大的影響。

本試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，露仁‘溫138’核桃WJ-PAL在內(nèi)果皮硬化的8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)量存在明顯差異，其中前期的相對(duì)表達(dá)量均較低，在核桃硬核期的花后100 d達(dá)到最大值，是前期的近100倍，對(duì)照‘紙皮’核桃ZJ-PAL在內(nèi)果皮硬化的8個(gè)時(shí)期基因表達(dá)量差異較小，在花后51～100 d間相對(duì)表達(dá)量變化較小，在花后71 d出現(xiàn)最低值，這與薛應(yīng)鈺的研究有一定的出入。美洲南瓜(Cucurbitapepo)研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量隨種子的成熟顯著降低，其種仁裸露裸仁現(xiàn)象是由于種皮發(fā)育過(guò)程中厚壁組織中缺乏木質(zhì)素的合成和積累；時(shí)空表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，裸仁美洲南瓜在授粉后的8 ～18 d種皮中隨木質(zhì)素的合成和積累PAL酶活性逐漸升高，隨后PAL酶活性明顯降低[24]。在自交授粉20 d后，PAL基因在硬殼完整美洲南瓜種皮中表達(dá)量上升，在裸仁美洲南瓜種皮中表達(dá)量則下降；其中在同一時(shí)期有殼美洲南瓜的表達(dá)量遠(yuǎn)高于裸仁美洲南瓜中的表達(dá)量[11]。本試驗(yàn)相對(duì)定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAL基因在硬殼完整核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量低于同期露仁核桃內(nèi)果皮中的表達(dá)量，本結(jié)果與美洲南瓜研究有較大的出入。說(shuō)明在核桃生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，PAL基因在露仁核桃中的表達(dá)量與酶活性具有一定同步性，‘溫138’核桃內(nèi)果皮出現(xiàn)露仁現(xiàn)象可能由于前期木質(zhì)素代謝中間產(chǎn)物形成太少，進(jìn)一步說(shuō)明了露仁核桃內(nèi)果皮形成的原因可能是由于前期缺乏木質(zhì)素代謝產(chǎn)物的積累。本試驗(yàn)結(jié)果可以看出在硬核期木質(zhì)素的改變對(duì)核桃內(nèi)果皮發(fā)育存在一定影響，核桃出現(xiàn)露仁現(xiàn)象與PAL活性的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

通過(guò)基因克隆獲得露仁核桃及硬殼完整核桃內(nèi)果皮PAL基因，WJ-PAL與ZJ-PAL推導(dǎo)氨基酸序列存在相同的非特異性位點(diǎn)、功能結(jié)構(gòu)域，均屬于Lyase_I_Like超家族，黑核桃序列相似性極高。露仁核桃‘溫138’前期PAL基因表達(dá)遠(yuǎn)低于后期表達(dá)，核桃露仁現(xiàn)象可能由于內(nèi)果皮硬化過(guò)程前期木質(zhì)素積累不足造成。