趙 闊，張紅建，陳 艷，鄒 易，謝嬌梅，鄭聯(lián)合

（海南省糧油科學(xué)研究所，海南瓊海 571400）

高血壓是困擾全球的一種心血管疾病，常伴有血管、大腦、心、腎等器官器質(zhì)性病變，是誘發(fā)中風(fēng)、冠心病、腦卒死、心肌梗死和腎功能衰竭的最主要因素，被稱為“無聲殺手”[1-3]，已發(fā)展成為一個十分嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題[4]。我國目前的高血壓患者達(dá)2.7億人[5]，發(fā)病率隨著經(jīng)濟(jì)的增長逐年增高，每年死于心血管疾病的人數(shù)達(dá)200萬人。當(dāng)前，應(yīng)用最普遍、藥效最明顯的主要是卡托普利、賴諾普利等人工合成的降血壓藥物，但對腎臟存在一定副作用，服藥后會出現(xiàn)干咳、低血壓等癥狀[6]。

降血壓肽，是一類能夠降低血壓的多肽活性物質(zhì)，通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE） 的活性，阻礙血管緊張素Ⅱ的生成及抑制血管舒緩激肽的分解，從而使血壓下降[7-8]。降血壓肽來源于食物蛋白，安全性高、無毒副作用，且對血壓正常者無降壓作用，適合長期服用，無論在功能性食品還是在醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)方面都具有廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。

羅非魚（Tilapia）俗稱非洲鯽魚、福壽魚，肉質(zhì)厚、白潔無刺、味道鮮美，在國際市場很受歡迎，是海南水產(chǎn)品加工企業(yè)出口的主要魚種之一。羅非魚加工會產(chǎn)生大量的下腳料，如魚鱗、魚頭、魚內(nèi)臟、殘肉等，總質(zhì)量約占整條魚的54%[11-12]，造成蛋白資源的浪費。為提高羅非魚下腳料的附加值，開展了酶解制備降血壓肽的研究，并優(yōu)化了工藝參數(shù)，為降血壓肽的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚下腳料：市購新鮮羅非魚，將魚肉剔除，于-20℃條件下凍存，試驗時于4℃下解凍。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE），從新鮮豬肺中提取；胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-8000S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；HDK-6型數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州德科儀器制造有限公司產(chǎn)品；S-D200型高效組織搗碎機，上海模具廠產(chǎn)品；Sigma 3-30k型高速冷凍離心機，上海譽鑫科技有限公司產(chǎn)品；RG-18型磁力攪拌器，上海瑪尼儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；QDN-ll型全自動凱氏定氮儀，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PB-10型pH計，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SB5200DTD型超聲波清洗機，寧波新藝生物科技有限公司產(chǎn)品；玻璃干燥器，沈陽一化玻商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；AY220型電子天平，日本島津公司產(chǎn)品；UPN-11-10T型超純水制造系統(tǒng)，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚下腳料酶解

稱取一定質(zhì)量的羅非魚加工下腳料，將其剪成小塊，按所需底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)加水，用高速組織搗碎機絞碎，調(diào)節(jié)所需pH值，在設(shè)定溫度下加酶水解一定時間，沸水浴滅活10 min，冷卻后以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min，中間部分的澄清液即為酶解液。

1.3.2 蛋白酶的篩選[13]

選取6種常用蛋白酶（堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶），結(jié)合生產(chǎn)廠家提供的各種蛋白酶的最適酶解條件，調(diào)節(jié)pH值和酶解溫度，分別對羅非魚下腳料進(jìn)行水解，根據(jù)水解度和ACE抑制率，篩選出最佳用酶。

蛋白酶水解條件見表1。

表1 蛋白酶水解條件

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

選取水解作用較強的酶，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值4個因素開展L16（35）正交試驗，以水解度和ACE抑制率為指標(biāo)，對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.3.4 水解度測定的方法[14]

水解度（DH） 指蛋白質(zhì)分子發(fā)生酶解反應(yīng)后斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例，反映蛋白質(zhì)的水解程度。

氨基酸態(tài)氮（AAN） 含量的測定（參照GB 5009.235—2016中比色法）。

總氮含量的測定（參照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法）。

1.3.5 ACE抑制率測定的方法[15]

在 2 mL離心管中混合 50 μL樣品和 200 μL 0.005 mol/L HHL。置于37℃水浴中預(yù)熱5 min，然后加入50 μL粗提的ACE啟動反應(yīng)；于37℃下水浴30 min，而后加0.2 mL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)；吸取1.2 mL預(yù)冷的乙酸乙酯于管中，用力振蕩混合，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心5 min。吸取0.8 mL上層液于試管中，于85℃烘箱中烘干；最后，加入4 mL去離子水溶解馬尿酸，于波長228 nm處測定其吸光度。對照組不加入抑制劑，空白組反應(yīng)前加入0.2 mL 1 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，其余操作與樣品組操作一致。

式中：ODa——對照組的吸光度；

ODb——樣品組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

6種蛋白酶分別在各自最適酶解條件下酶解處理羅非魚加工下腳料。

不同蛋白酶酶解羅非魚下腳料效果見圖1。

由圖1可知，6種蛋白酶對羅非魚下腳料的酶解能力由高到低依次為復(fù)合蛋白酶＞胃蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶；各酶解液ACE抑制率由高到低依次為復(fù)合蛋白酶＞胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。水解度低的中性蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE抑制率卻不低，可見水解度和ACE抑制率并無顯著直線線性關(guān)系，分析原因可能是因為各蛋白酶的作用方式和作用位點有所不同，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物ACE抑制率不同。綜合考慮，確定選取復(fù)合蛋白酶為目標(biāo)用酶，該酶反應(yīng)條件相對溫和、試驗條件易于控制、水解度和ACE抑制率相對較高。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響

配制5份底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的羅非魚下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，加入復(fù)合蛋白酶，加酶量（E/S%） 為 10 000 U/g，分別在 40，45，50，55，60℃下酶解5 h，之后沸水浴中加熱10 min，離心，測定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同溫度對酶解反應(yīng)的影響。

酶解溫度對酶解反應(yīng)的影響見圖2。

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，水解度和抑制率均呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50℃時，水解度和抑制率達(dá)到最高；當(dāng)酶解溫度超過50℃，酶活性降低，水解度和抑制率開始下降。適宜溫度是保持酶活力的關(guān)鍵，不適宜的溫度會破壞蛋白酶活性部位的完整性，從而對其酶解作用能力造成影響。因此，復(fù)合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳酶解溫度為50℃。

2.2.2 加酶量對酶解反應(yīng)的影響

配制5份底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的羅非魚下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值至7，加入復(fù)合蛋白酶，加酶量（E/S%） 分別為 6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 U/g，于50℃下酶解5 h，滅活、離心，測定各酶解液的水解度和ACE抑制率，分析不同加酶量對酶解反應(yīng)的影響。

加酶量對酶解反應(yīng)的影響見圖3。

由圖3可知，水解度隨加酶量的增加而增大，并逐漸趨于平緩。加酶量增加到12 000 U/g時，酶解液ACE抑制率最高，之后加酶量增加ACE抑制率降低，可能是因為酶活過高引起了降血壓肽的進(jìn)一步水解。因此，復(fù)合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳加酶量為12 000 U/g。

2.2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解反應(yīng)的影響

配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%，15%，20%，25%，30%的羅非魚下腳料溶液各1份，調(diào)節(jié)pH值至7，加入復(fù)合蛋白酶，加酶量（E/S%）為10 000 U/g，于50℃下水解5 h，滅活、離心，測定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解反應(yīng)的影響。

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解反應(yīng)的影響見圖4。

由圖4可知，酶解度和抑制率隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加基本呈上升趨勢，分析原因可能是因為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時，降低了酶的濃度，使得酶與底物無法充分接觸，影響了酶解效果，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到20%時，水解度和抑制率達(dá)到最大值，之后，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加水解度變化不明顯，抑制率略有下降。因此，復(fù)合蛋白酶水解羅非魚加工下腳料的最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

2.2.4 pH值對酶解反應(yīng)的影響

配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的羅非魚下腳料溶液5份，分別調(diào)節(jié)pH值至 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，加入復(fù)合蛋白酶，加酶量（E/S%） 為10 000 U/g，在水解溫度50℃下酶解5 h，滅活，離心，測定各酶解液的酶解度和ACE抑制率，分析不同pH值對酶解反應(yīng)的影響。

pH值對水解反應(yīng)的影響見圖5。

由圖5可知，pH值＜7.5時，水解度和抑制率隨著pH的升高而增加；pH值＞7.5時，pH值升高水解度和ACE抑制率反而減小。pH值直接影響到酶和底物分子的某些解離狀態(tài)，從而影響酶解效果。因此，復(fù)合蛋白酶解羅非魚下腳料的最佳pH值為7.5。

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值4個因素，以酶解度和ACE抑制率為指標(biāo)，開展正交試驗。

復(fù)合蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果見表3，復(fù)合蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果方差分析見表4。

表3 復(fù)合蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果

由表3可知，影響水解度的因素主次順序為A＞C＞D＞B，即酶解溫度＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞加酶量，最優(yōu)組合為A2B3C3D3；而影響抑制率的因素主次順序為C＞A＞D＞B，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞水解溫度＞pH值＞加酶量，最優(yōu)組合為A2B2C3D3。2個組合的差別僅在于因素B是取第二水平還是第三水平。由表4可知，水解溫度（A） 和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C） 對水解度和抑制率均影響顯著，加酶量（B）和pH值（D）對水解度合抑制率均沒有顯著影響，且加酶量對抑制率影響比對水解度影響要強。因此，將加酶量的最適條件優(yōu)化為B2，符合蛋白酶水解工藝的最適組合為A2B2C3D3，即水解溫度47℃，加酶量12 000 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，pH值7.5。以最適組合條件進(jìn)行驗證試驗，羅非魚下腳料酶解度和抑制率分別為77.45%和70.12%。

表4 復(fù)合蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果方差分析

3 結(jié)論

通過對比胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等6種蛋白酶酶解羅非魚下腳料的效果，確定復(fù)合蛋白酶為目標(biāo)用酶，該酶反應(yīng)條件相對溫和、試驗條件易于控制、水解度和ACE抑制率相對較高。通過單因素試驗和正交試驗，對復(fù)合蛋白酶水解羅非魚下腳料制備降血壓肽的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，最適條件為水解溫度47℃，加酶量12 000 U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，pH值7.5，此工藝條件下酶解度與抑制率分別為77.45%和70.12%。