李永春，王菊平，李小芹△，鄭俊霞

(1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院消化科，鄭州 450018；2.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450018；3.許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，河南許昌 461000)

膽汁淤積型肝損傷是由于肝細(xì)胞和(或)毛細(xì)膽管排泌障礙引起膽汁流出部分或完全阻滯，引起肝臟損傷。膽汁淤積時(shí)進(jìn)入腸道內(nèi)的膽汁減少，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞間緊密連接表達(dá)減少，腸黏膜通透性增加，引起腸道功能紊亂、腸源性感染。腸黏膜受損時(shí)，腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，激活肝內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重肝損傷，形成惡性循環(huán)[1]。益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群生態(tài)平衡，改善腸黏膜通透性，有研究顯示其可降低膽紅素，改善肝損傷[2-3]。本研究旨在探索蠟樣芽孢桿菌(bacillus cereus，Bc)對膽汁淤積大鼠肝損傷和腸黏膜通透性的影響，并分析小腸組織中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)變化，為臨床治療膽汁淤積及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 動(dòng)物：40只雄性SD大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g。試劑：Bc活菌膠囊購自安陽市源首生物藥業(yè)有限責(zé)任公司；α-荼基異硫氰酸鹽(ANIT)購自美國Sigma 公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清總膽紅素(T-BIL)、二胺氧化酶(DAO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；乳酸(LA)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；兔抗Occludin、ZO-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1造模方法 將40只雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表分為對照組、模型組及Bc低、高劑量組，每組10只。除對照組外，其余大鼠均單次灌胃ANIT(50 mg/kg)橄欖油溶液建立大鼠膽汁淤積模型[4]；Bc低、高劑量組于造模次日開始灌胃Bc(1.0×108、2.0×108CFU/kg)，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，均每天1 次，連續(xù)5 d。

1.2.2肝功能和腸黏膜通透性檢測 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，按照試劑盒說明書檢測血清中ALT、AST、DAO的活性和T-BIL、LA水平。

1.2.3肝組織病理檢測 采血后分離大鼠肝臟，取固定部位經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后于顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測 采血后取大鼠小腸，常規(guī)脫水、包埋，切片，二甲苯脫蠟后乙醇水化，抗原修復(fù)后分別滴加Occludin、ZO-1一抗(1∶800)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法孵育二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后復(fù)染，顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細(xì)胞。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析Occludin、ZO-1免疫反應(yīng)陽性的累積光密度值(integrated optical density，IOD)。每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野分析，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝功能檢測指標(biāo)比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT和T-BIL水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，Bc高劑量組大鼠血清ALT、AST及T-BIL水平均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝功能檢測指標(biāo)比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.2各組大鼠血清LA和DAO水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清LA和DAO水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，Bc低、高劑量組大鼠血清LA和DAO水平均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清LA和DAO水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A：對照組；B：模型組；C：Bc低劑量組；D：Bc高劑量組

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠肝組織病理結(jié)果比較 普通光鏡下，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈整齊的索狀排列，細(xì)胞形態(tài)正常無變性壞死，匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組肝細(xì)胞腫脹、空泡樣變形，壞死，細(xì)胞排列紊亂，匯管區(qū)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，局部有膽管增生；Bc低、高劑量組肝組織病理損傷明顯較模型組為輕，肝細(xì)胞排列相對正常，少見炎性浸潤，尤其是Bc高劑量組，炎性細(xì)胞及肝細(xì)胞壞死明顯減少，見圖1。

2.4各組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1的表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，Bc低、高劑量組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，見圖2、3。

3 討 論

自從馬歇爾提出了“肝腸軸”的概念，肝臟疾病與腸道之間的相互作用就逐漸受到關(guān)注[5]。肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)排進(jìn)腸道內(nèi)膽汁減少，導(dǎo)致腸黏膜上緊密連接表達(dá)減少，腸上皮細(xì)胞間緊密連接斷裂，腸黏膜屏障受損，通透性增加，腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，激活肝內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)和免疫應(yīng)答，引起或加重肝損傷?；诟文c軸的存在，改善腸黏膜通透性、保護(hù)腸黏膜屏障可能是治療肝臟相關(guān)疾病的切入點(diǎn)[6]。

腸道內(nèi)的菌群不僅在人體消化吸收、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮作用，其作為肝腸軸的重要媒介，與肝硬化、肝性腦病、膽汁淤積、脂肪性肝病等有關(guān)[7]。有研究證實(shí)，益生菌可能通過改善腸道菌群、調(diào)節(jié)腸道屏障功能等機(jī)制進(jìn)而改善患者肝臟功能的作用[8]。本研究顯示Bc可降低膽汁淤積大鼠血清中AST、AST及T-BIL水平，改善肝組織病理，表明Bc具有改善膽汁淤積大鼠肝損傷的作用。

DAO是存在于腸黏膜上層絨毛細(xì)胞中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，細(xì)胞受損后DAO 進(jìn)入淋巴管和血液系統(tǒng)，導(dǎo)致血液中DAO 活性增加，DAO是反映小腸黏膜通透性的敏感指標(biāo)[9-10]。LA是胃腸道固有細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物不具備將其分解的酶，腸黏膜正常時(shí)很少被機(jī)體吸收，測定血清中LA水平能夠反映腸黏膜的完整程度和通透性的改變[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的血清中LA和DAO水平較對照組大鼠明顯升高(P<0.05)，說明膽汁淤積大鼠的腸黏膜屏障受到損傷，結(jié)構(gòu)受到破壞，Bc干預(yù)后，大鼠血清中LA、DAO水平降低，表明Bc可改善大鼠腸黏膜通透性，對腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。

腸黏膜上皮細(xì)胞與細(xì)胞間連接形成完整的生物屏障，細(xì)胞間連接以緊密連接最為重要，控制著物質(zhì)跨膜運(yùn)輸及維持細(xì)胞的極性[12]。緊密連接包括Occludin、周膜蛋白緊密連接蛋白家族和Claudin跨膜蛋白家族，Occludin表達(dá)于細(xì)胞基側(cè)膜頂端，與其他蛋白構(gòu)成緊密連接的基本結(jié)構(gòu)，調(diào)控上皮細(xì)胞的跨上皮電阻和膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能[13]。ZO-1則在連接Occludin中起橋梁作用，是Occludin與細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)連接的關(guān)鍵物質(zhì)，對腸上皮起穩(wěn)定作用[14]。緊密連接表達(dá)的改變可能是膽汁淤積時(shí)腸黏膜屏障損傷的重要原因[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的小腸組織中Occludin和ZO-1表達(dá)水平較對照組大鼠明顯減少，Bc干預(yù)后，大鼠小腸組織中Occludin和ZO-1表達(dá)增加。緊密連接是腸黏膜屏障完整的基礎(chǔ)，這提示Bc上調(diào)大鼠腸黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)可能是其改善腸黏膜通透性，進(jìn)而保護(hù)肝損傷的關(guān)鍵因素。

綜上所述，Bc可能通過改變腸黏膜通透性、增加緊密連接蛋白表達(dá)進(jìn)而通過肝腸軸對膽汁淤積大鼠肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，然而肝腸之間相互作用復(fù)雜，Bc保護(hù)肝損傷的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。