周輝 余淦 徐華 葉章群

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是生物體產(chǎn)生的一類不具有蛋白編碼功能的RNA轉(zhuǎn)錄本，其通常序列大于200 bp。此類RNA分子在以往被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄垃圾”，但目前越來(lái)越多的研究顯示，lncRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)進(jìn)程中都發(fā)揮著舉足輕重的作用，也在包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1-3]。BRE-AS1又名NR_028308，位于人類染色體2p23.2，是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子，序列長(zhǎng)度為1 667 bp。BRE-AS1為BRE基因的反義RNA，我們前期的lncRNA表達(dá)譜研究顯示BRE-AS1在腎細(xì)胞癌組織中顯著低表達(dá)，但其在腎細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及具體的分子機(jī)制仍不明確[4]。為了對(duì)其生物學(xué)功能及機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們需要構(gòu)建其表達(dá)載體。慢病毒載體以人免疫缺陷Ⅰ型病毒(HIV-1)的結(jié)構(gòu)基因?yàn)榛A(chǔ)，可將目的基因整合到宿主細(xì)胞的基因組上，可高效率、持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)外源性基因；此外，慢病毒對(duì)分裂期及非分裂期細(xì)胞均具有較強(qiáng)感染力，且具有較低免疫原性，通常不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性造成較大影響[5-6]。由于這些優(yōu)勢(shì)，慢病毒表達(dá)系統(tǒng)在生物學(xué)研究中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。本研究通過(guò)構(gòu)建BRE-AS1基因的慢病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究BRE-AS1在腎細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及分子學(xué)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

慢病毒表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)包括載體穿梭質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-copGFP、慢病毒結(jié)構(gòu)質(zhì)粒pPACKH1質(zhì)粒體系(pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pPACKH1-VSVG)，購(gòu)自美國(guó)SBI公司。轉(zhuǎn)染試劑為瑞士羅氏公司生產(chǎn)的X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，慢病毒病毒沉淀劑PEG6000購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。DH5α感受態(tài)大腸桿菌購(gòu)自武漢翰林博公司。質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液、胰酶、PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；TRIzol試劑、KOD-plus高保真聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶分別購(gòu)自美國(guó)Invitrogen、日本TOYOBO、日本TAKARA、瑞士Roche、美國(guó)Thermo公司。引物合成及DNA鑒定由武漢擎科生物公司完成。EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.重疊延伸PCR法獲取BRE-AS1目的序列：根據(jù)NCBI檢索，確定BRE-AS1的序列，設(shè)計(jì)引物：擴(kuò)增BRE-AS1序列全長(zhǎng)的引物BA-F：5′-CGGAATTCGTATGATTCCCCTCATCAGGCA-3′(含EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)，BA-R：5′-ATTTGCGGCCGCTTTGGAATATCTGAATTTATTACT-3′(含Not Ⅰ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。 提取293TN細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為模板，利用KOD-plus高保真聚合酶進(jìn)行PCR。由于前后引物解鏈溫度(Tm)差別較大，未能得到正確的PCR產(chǎn)物，我們?cè)O(shè)計(jì)了新的PCR引物，進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)。用于重疊延伸PCR的引物序列：BA-F1:5′-CTGTCACCTTTCACCATGTTGATTGTCGGCA-3′，BA-R1：5′-TGCCGACAATCAACATGGTGAAAGGTGACAG-3′。BA-F及BA-R1用于PCR得到產(chǎn)物為1 400 bp，BA-F1及BA-R用于PCR得到產(chǎn)物為311 bp；將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收后混合作為模板，用BA-F及BA-R進(jìn)行PCR得到產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 680 bp。此外，設(shè)計(jì)并合成BRE-AS1實(shí)時(shí)定量PCR前后引物，引物序列分別為F0 5′-AGGCAGTGGCAAGAGGAGGTG-3′及R0 5′-TCGGAGGTAAAATGACGTGGG-3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為431 bp。

2.重組BRE-AS1慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：將目的片段及pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-copGFP載體分別由EcoR Ⅰ及Not Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離純化，回收酶切的載體和目的基因片段。將酶切回收的載體DNA、目的基因片段、Ligation High連接酶混勻并孵育2 h，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，并接種到含氨芐青霉素的軟瓊脂平板。挑選菌落利用實(shí)時(shí)定量PCR引物進(jìn)行PCR，得到陽(yáng)性菌落后進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序正確的菌落再用于質(zhì)粒提取，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.慢病毒包裝：根據(jù)慢病毒包裝說(shuō)明書，于6孔板中培養(yǎng)293TN細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～80%時(shí)開始進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。首先制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物(6孔板每孔)：于1.5 ml離心管中加入200 μl的opti-MEM培養(yǎng)液，依次加入1 600 ng的目的質(zhì)粒及3種慢病毒結(jié)構(gòu)質(zhì)粒(各800 ng)后，加入10 μl轉(zhuǎn)染試劑，混勻后孵育20 min，均勻加入293TN細(xì)胞的培養(yǎng)液中，搖晃混勻。置于37 ℃、5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后換液，并繼續(xù)培養(yǎng)96 h。收集293TN細(xì)胞上清液，以0.22 μm濾器過(guò)濾上清液。在病毒上清液中加入適量PEG6000病毒沉淀劑，于4 ℃沉淀過(guò)夜后，在離心機(jī)上以1 500 g速度離心30 min后可得到白色沉淀，棄上清保留白色沉淀，然后冰PBS液重懸病毒沉淀，并于4 ℃溶解過(guò)夜。

4.慢病毒滴度測(cè)定：采用稀釋滴定法，將慢病毒溶液按10倍梯度稀釋為原濃度的1/10、1/102、1/103、1/104、1/105、1/106共6個(gè)濃度梯度，分別感染接種293TN細(xì)胞。96孔板每個(gè)孔中加入90 μl培養(yǎng)液及10 μl稀釋病毒液，各稀釋梯度分別行3個(gè)復(fù)孔。72 h后利用倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)各濃度梯度下有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，并取平均值。慢病毒滴度=細(xì)胞數(shù)平均值×稀釋度×100(TU/ml)。

5.感染目的細(xì)胞及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞篩選鑒定：將收集的BRE-AS1重組慢病毒和對(duì)照空病毒分別感染腎細(xì)胞癌細(xì)胞系OS-RC-2，72 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。用嘌呤霉素(終濃度2 μg/ml)篩選帶抗性細(xì)胞2周，得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因的細(xì)胞。提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，確定BRE-AS1的表達(dá)水平。

6.EdU插入實(shí)驗(yàn)：采用EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將處理好的細(xì)胞種植到24孔板中，待細(xì)胞密度約70%～80%時(shí)，每孔加入稀釋好的EdU培養(yǎng)液孵育2 h，清洗細(xì)胞后以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用2 mg/ml甘氨酸終止反應(yīng)。其后加入Apollo染色反應(yīng)液，在室溫下避光搖床孵育30 min，清洗后再加入Hoechst33342反應(yīng)液進(jìn)行DNA染色，清洗后在熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。EdU為胸腺嘧啶核苷類似物，能摻入正在復(fù)制的DNA分子，與Apollo熒光染料反應(yīng)能使增殖細(xì)胞的核產(chǎn)生紅色熒光；而Hoechst33342能使所有細(xì)胞的細(xì)胞核產(chǎn)生藍(lán)色熒光，因此帶紅色熒光與帶藍(lán)色熒光的細(xì)胞核的比例即為增殖細(xì)胞所占比例。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；定性資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BRE-AS1目的片段的重疊延伸PCR

擴(kuò)增BRE-AS1序列全長(zhǎng)的引物BA-F及BA-R用于PCR，未能得到預(yù)測(cè)長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物，因此我們進(jìn)行了重疊延伸PCR來(lái)得到BRE-AS1目的片段。與重疊延伸PCR的模式圖(圖1A)相一致，BA-F及BA-R1用于PCR得到產(chǎn)物大小約為1 400 bp，而BA-F1及BA-R用于PCR得到產(chǎn)物大小為311 bp(圖1B)；而將兩種PCR產(chǎn)物分別瓊脂糖凝膠純化及膠回收后混合作為模板，用BA-F及BA-R進(jìn)行PCR，得到產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 680 bp(圖1C)。條帶大小與預(yù)期各片段長(zhǎng)度一致。

A：重疊延伸PCR的模式圖；B：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)BRE-AS1長(zhǎng)、短片段的大小與預(yù)期一致，短片段條帶位于250～500 bp(大約311 bp)，而長(zhǎng)片段條帶位于1 000～1 500 bp(大約1 400 bp)；C：將長(zhǎng)、短片段分別進(jìn)行膠回收后混合作為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，獲取BRE-AS1全長(zhǎng)片段后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一條明顯的條帶位于1 500～2 000 bp(大約1 680 bp)

圖1 利用重疊延伸PCR進(jìn)行BRE-AS1目的條帶獲取

二、pCDH-BRE-AS1載體的構(gòu)建與鑒定

利用EcoR Ⅰ及Not Ⅰ內(nèi)切酶，分別切割BRE-AS1目的片段及pCDH質(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化目的片段后，依次進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑菌落克隆、PCR鑒定、DNA測(cè)序。DNA測(cè)序正確的菌落，搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI上BRE-AS1的RNA序列(NR_028308)進(jìn)行比對(duì)，顯示序列均一致(圖2)，表明重組載體構(gòu)建正確。將該BRE-AS1表達(dá)載體質(zhì)粒稱為pCDH-BRE-AS1，空載體為pCDH-empty。

圖2 pCDH-BRE-AS1載體的測(cè)序鑒定

三、重組慢病毒的包裝及滴度測(cè)定

將pCDH-BRE-AS1轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞獲得病毒液，按梯度稀釋后感染293TN細(xì)胞，根據(jù)公式計(jì)算出重組慢病毒的最終滴度。在本實(shí)驗(yàn)中BRE-AS1重組慢病毒的滴度為8.6×107TU/ml，BRE-AS1病毒液的合適稀釋濃度為1/104倍。

四、感染目的細(xì)胞及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞篩選鑒定

用過(guò)表達(dá)BRE-AS1的慢病毒液及空載體病毒液分別感染OS-RC-2細(xì)胞，72 h后即可見(jiàn)部分細(xì)胞存在綠色熒光。利用嘌呤霉素篩選抗藥細(xì)胞2周后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，幾乎所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率接近100%(圖3A)。此外，被感染的OS-RC-2細(xì)胞均未出現(xiàn)顯著形態(tài)學(xué)變化或生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞狀態(tài)保持良好。提取細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于轉(zhuǎn)入空載體(pCDH-empty)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了目的序列(pCDH-BRE-AS1)的OS-RC-2細(xì)胞中，BRE-AS1的RNA表達(dá)水平增高約38.5倍(6.2個(gè)循環(huán))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3B)。結(jié)果表明pCDH-BRE-AS1慢病毒表達(dá)載體能有效過(guò)表達(dá)BRE-AS1，該細(xì)胞可用于后續(xù)研究。

A：熒光顯微鏡觀察(×200)；B：熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BRE-AS1表達(dá)

圖3 BRE-AS1慢病毒表達(dá)載體感染OS-RC-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)BRE-AS1

五、EdU插入實(shí)驗(yàn)顯示BRE-AS1抑制細(xì)胞增殖

將過(guò)表達(dá)BRE-AS1的OS-RC-2細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞種植于24孔板，利用EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行EdU插入實(shí)驗(yàn)。圖4A顯示了兩種細(xì)胞進(jìn)行EdU插入實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞核染色情況。3個(gè)視野中，對(duì)照細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞核與藍(lán)色熒光細(xì)胞核的比例分別為43.75%、48.25%、40.35%，計(jì)算出對(duì)照細(xì)胞中約44.00%的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)；而穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BRE-AS1的OS-RC-2細(xì)胞中，3個(gè)視野中紅色熒光細(xì)胞核與藍(lán)色熒光細(xì)胞核的比例分別為28.93%、23.49%、25.36%，計(jì)算出該細(xì)胞中約26.00%的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。相對(duì)于轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了目的序列(BRE-AS1)的OS-RC-2細(xì)胞中，增殖細(xì)胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=70.3，P<0.01)(圖4B)。結(jié)果顯示BRE-AS1可抑制腎癌細(xì)胞的增殖，可能在腎癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。

A：熒光顯微鏡顯示，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，在過(guò)表達(dá)BRE-AS1的OS-RC-2細(xì)胞中，紅色熒光細(xì)胞核(增殖細(xì)胞)的比例較低；B：BRE-AS1過(guò)表達(dá)組增殖細(xì)胞所占比例顯著降低

圖4 EdU插入實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)BRE-AS1抑制腎癌細(xì)胞的增殖

討 論

lncRNA能夠調(diào)節(jié)多種生物學(xué)進(jìn)程，參與多條信號(hào)通路并調(diào)控多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此其在疾病中的作用越來(lái)越受到重視[2-3]。BRE-AS1為BRE基因的反義RNA，但是不具備蛋白編碼功能，而是一種新的lncRNA。目前關(guān)于BRE-AS1的研究較少，張琳等[7]發(fā)現(xiàn)BRE-AS1在先天性小耳畸形患者的殘耳軟骨中表達(dá)水平顯著上調(diào)，顯示其與先天性小耳畸形的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)系。He等[8]則發(fā)現(xiàn)BRE-AS1在嫌色腎細(xì)胞癌中顯著下調(diào)，且高表達(dá)BRE-AS1的患者具有更好的總生存期。此外，Pruunsild等[9]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來(lái)源的小鼠神經(jīng)元中，BRE-AS1的表達(dá)水平受突觸活性調(diào)控，其可能參與神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)。在我們前期的腎細(xì)胞癌的lncRNA表達(dá)譜研究中，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)正常癌旁組織，BRE-AS1在腎細(xì)胞癌組織中顯著低表達(dá)[4]。盡管如此，BRE-AS1在腎細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及其具體的分子機(jī)制，仍不為人所知，有待進(jìn)一步研究。因此，構(gòu)建其過(guò)表達(dá)載體就具有較為重要的意義。

慢病毒載體系統(tǒng)是一種以HIV-1的結(jié)構(gòu)基因?yàn)榛A(chǔ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，慢病毒載體系統(tǒng)具有一系列優(yōu)勢(shì)使其獲得越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用：慢病毒能較好感染分裂期及非分裂期宿主細(xì)胞；慢病毒載體可容納較長(zhǎng)基因片段；目的基因可在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)；免疫原性較弱，較少誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，一般不引起細(xì)胞形態(tài)功能改變[5-6]。此外，慢病毒系統(tǒng)還能與最新的CRISPR/Cas9系統(tǒng)完美整合，高效在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯[10]。為更好地研究lncRNA BRE-AS1在腎細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及其機(jī)制，我們嘗試構(gòu)建了BRE-AS1的慢病毒表達(dá)載體，以期高效安全的進(jìn)行BRE-AS1過(guò)表達(dá)。本研究通過(guò)PCR得到BRE-AS1目的片段，將其重組到慢病毒載體中，成功構(gòu)建基因表達(dá)載體質(zhì)粒pCDH-BRE-AS1，并通過(guò)DNA測(cè)序鑒定表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。隨后我們通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)得到慢病毒并感染腎細(xì)胞癌OS-RC-2細(xì)胞系，利用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)BRE-AS1的腎細(xì)胞癌細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染效率接近100%，且感染后OS-RC-2細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞活力保持良好。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR，我們證明轉(zhuǎn)染了BRE-AS1慢病毒表達(dá)載體的OS-RC-2細(xì)胞中，BRE-AS1的RNA表達(dá)水平顯著增加。這些研究結(jié)果顯示，BRE-AS1慢病毒表達(dá)載體及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BRE-AS1的腎癌細(xì)胞構(gòu)建成功，這為后續(xù)進(jìn)一步研究BRE-AS1在腎細(xì)胞癌及其他疾病的發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能及潛在分子學(xué)機(jī)制，都奠定了良好基礎(chǔ)。而后續(xù)的EdU插入實(shí)驗(yàn)也顯示，過(guò)表達(dá)BRE-AS1能夠降低增殖的腎癌細(xì)胞的比例，說(shuō)明BRE-AS1能夠抑制腎細(xì)胞癌的增殖，BRE-AS1可能在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。這與其在腎細(xì)胞癌中顯著低表達(dá)也較為一致。但后續(xù)還需要更多的體內(nèi)及體外功能實(shí)驗(yàn)，來(lái)闡明BRE-AS1在腎細(xì)胞癌中確切的生物學(xué)功能。

此外，本研究的一個(gè)難點(diǎn)就是通過(guò)PCR得到BRE-AS1目的片段。BRE-AS1序列>1 500 bp，且其3′端序列中腺嘌呤(A)及胸腺嘧啶(T)的比例較高，利用頭尾序列設(shè)計(jì)引物Tm值相差較大，進(jìn)行PCR時(shí)無(wú)法得到目的序列，因此我們采用了重疊延伸PCR來(lái)獲取目的片段。重疊延伸PCR也稱為搭橋PCR，常用于獲取大片段基因序列、基因定點(diǎn)突變、融合基因構(gòu)建等，具有一系列優(yōu)勢(shì)[11-13]。本研究為獲取BRE-AS1全長(zhǎng)片段，將其分為前后兩段，分別進(jìn)行PCR后，將PCR產(chǎn)物混合作為DNA模板，再次進(jìn)行PCR得到了正確的BRE-AS1目的片段。因此，為獲取較長(zhǎng)序列或前后引物Tm值懸殊的目的片段，重疊延伸PCR技術(shù)不失為一種值得嘗試的好辦法。