郭帥 趙曉俊 周政 浦金賢 江弢

全世界范圍內，膀胱腫瘤為第五大惡性腫瘤，傳統(tǒng)的檢查方法有膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查。膀胱鏡是公認的確診膀胱腫瘤的金標準，但其價格不低，且會給患者帶來一定的不適感[1]；尿脫落細胞學雖然可在一定程度上彌補膀胱鏡的不足，但其存在敏感性較差的缺陷，特別是針對低級別移行細胞癌[2-3]。

巢蛋白(nidogen， NID)家族包括NID1、NID2，是基底膜的主要構成成分之一，基底膜在細胞的分化、增殖和遷移方面發(fā)揮著重要的作用，因此，NID基因的異常表達易造成細胞膜的不穩(wěn)定而引起病變[4-5]。同源盒(HOX)基因的編碼產物是一種重要的轉錄調節(jié)因子，在控制胚胎發(fā)育和調節(jié)細胞分化過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。關于膀胱腫瘤與NID2和HOXA9基因的相關性，目前國外有研究顯示腫瘤患者尿液樣本中NID2和HOXA9基因甲基化水平顯著高于正常對照者[8-12]。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)技術對膀胱腫瘤患者尿液標本中NID2和HOXA9基因甲基化水平進行了檢測，以明確其在膀胱腫瘤診斷中的應用價值。

對象與方法

一、一般資料

2015年4月至2017年6月蘇州大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科收治的原發(fā)性膀胱尿路上皮癌患者70例納入研究，70例患者均為首次確診，之前未經手術及化療等治療。70例中男48例、女22例，年齡41～81歲，中位年齡63歲。參照WHO(2004)標準進行腫瘤分級(低度惡性潛能-LMP、低級別-Low和高級別-High)，參照TNM(2010)進行臨床分期。納入研究的70例患者的尿液標本作為實驗組，另采集60例泌尿系其他疾病患者的尿液標本作為對照組，對照組中男35例、女25例，年齡37～73歲，中位年齡54歲(表1)。收集的尿液標本為術前晨尿中間段(50 ml)，完成收集后立刻轉入-20 ℃冰箱保存。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有受試對象均知情同意。

表1 實驗組與對照組一般資料

二、尿脫落細胞DNA的提取

取5 ml尿液樣本，采用通用型基因組DNA提取試劑盒(CWO 0550，康為世紀)提取尿脫落細胞總DNA，提取的DNA樣本于-20 ℃冰箱保存。

三、MSP檢測

采用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(EZ-DNA Methylation-Gold kit,ZYMO Research)進行DNA的亞硫酸氫鹽修飾及純化，用亞硫酸氫鹽修飾過的T47D作為陽性質控品，293作為陰性質控品，ddH2O作為對照進行PCR擴增。甲基化特異性引物序列NID2順義鏈：5′-GTTTCGCGGTTTTTAAGGA-3′,反義鏈：5′-ACGCTAAACTCATCTCCTAC-3′,探針：5′-GTTCGTAAGGTTTGGGGTAGCG-3′;甲基化特異性引物序列HOXA9順義鏈：5′-GTTATTATCGTGTTTAGCG-3′，反義鏈：5′-CGATACCACCAAATTATTA-3′，探針：5′-GTTCGTTCGGTTCGATTTACG-3′;內參基因ACTB順義鏈：5′-GGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，反義鏈：5′-CAATAAAACCTACTCCTCCC-3′，探針：5′-CACCACCCAACACACAATA-3′。甲基化反應體系為20 μl，5 μl修飾的DNA模板，每種dNTP濃度均為0.25 mmol/L，每種引物濃度均為0.4 μmol/L，2單位Taq 聚合酶。反應過程：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，61 ℃復性延伸40 s，共計45個循環(huán)。兩個基因有一個基因CT值<35即判定為陽性，其中內參通道CT值>30，判讀樣本為不合格樣本。每例樣本設置3個對照：甲基化陽性、陰性對照及水作為空白對照。

四、統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計數資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，組內比較采用Fisher確切概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。診斷敏感性和特異性采用受試者工作曲線(ROC)進行分析，并計算其曲線下面積(AUC)。

結 果

一、尿液標本NID2、HOXA9甲基化水平

實驗組尿液標本NID2甲基化率檢測靈敏度為74%(52/70)，特異度為85%(51/60)，NID2甲基化檢測結果見圖1；HOXA9甲基化率檢測靈敏度為84%(59/70)，特異度為93%(56/60)，HOXA9甲基化檢測結果見圖2；雙指標聯(lián)合檢測的靈敏度為89%(62/70)，特異度為80%(48/60)。實驗組與對照組基因甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，不同分期和分級腫瘤尿液樣本基因甲基化狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.485、0.241) (表2)。

圖1 NID2基因甲基化檢測結果(紅色為陽性，綠色為陰性)

表2 實驗組及對照組尿液標本基因甲基化檢測結果及診斷效能

圖2 HOXA9基因甲基化檢測結果(紅色為陽性，綠色為陰性)

70例膀胱腫瘤患者尿脫落細胞學檢測結果顯示，31例為陽性或可疑，靈敏度為44%(31/70)，特異度為78%(47/60)。雙指標聯(lián)合檢測的靈敏度和特異度均高于尿脫落細胞學檢測。

二、ROC及AUC

膀胱腫瘤患者尿液標本NID2基因甲基化的AUC為0.84(0.77～0.91)，HOXA9基因甲基化的AUC為0.91(0.85～0.96)，雙指標聯(lián)合檢測的AUC為0.92(0.87～0.97)。雙基因甲基化聯(lián)合檢測的ROC見圖3。

圖3 NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測ROC

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因環(huán)境的相互作用和病因學有密切的關聯(lián)[13]，基因突變在腫瘤進展過程中發(fā)揮重要作用，但在表觀遺傳學中，基因的甲基化未改變基因的序列，而是通過改變構型影響基因的轉錄，繼而引起基因沉默[14]。CpG二核苷酸是最主要的甲基化位點，CpG通常以兩種形式存在，一種是分散于DNA中，另一種是CpG結構高度聚集的CpG島[15]。正常組織中分散于DNA中的CpG的位點通常是甲基化的，而位于健康人基因啟動子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)[16]，CpG島甲基化可引起相關基因的沉默，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-18]。

Reinert等[11]使用基因芯片對膀胱腫瘤基因中27 000個CpG島進行了研究，從中發(fā)現了多個異常甲基化的位點，部分有可能成為預測膀胱腫瘤的標志物，膀胱腫瘤組織中HOXA9基因的甲基化特異性和敏感性分別達到了74%和96%。國外已有學者使用MSP技術檢測膀胱腫瘤患者尿脫落細胞NID2的甲基化狀態(tài)，取得了良好的實驗結果，其敏感性和特異性均高于尿脫落細胞學檢測[10，12]，但相關研究在國內鮮有報道。

本研究分析了膀胱腫瘤患者尿液標本中NID2和HOXA9基因甲基化表達情況。研究發(fā)現實驗組尿液標本中NID2和HOXA9基因的甲基化率較高，分別達到了74%和84%，對照組尿液標本中基因甲基化率分別僅為15%和7%，差異有統(tǒng)計學意義，但統(tǒng)計結果提示甲基化與腫瘤的分級、分期等臨床參數無顯著相關性，該結論與國內外一些研究結果相一致[12，19]。但也有研究認為基因甲基化與膀胱腫瘤的分級、分期等臨床參數有關，特別是在低分化膀胱腫瘤組織中更易檢出[20-21]。NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測的AUC值為0.92，高于任一單基因檢測，表明聯(lián)合檢測有更高的價值。

Renard等[10]于2010年首次報道了膀胱腫瘤尿液中NID2的表達情況，顯示出較高的敏感性和特異性。Reinert等[8]于2012年首次報道了HOXA9對膀胱腫瘤的診斷價值，并且認為其在監(jiān)測膀胱腫瘤復發(fā)中具有重要作用。Scher等[22]使用巢式PCR技術檢測尿液標本中NID2基因，發(fā)現NID2基因與膀胱腫瘤有密切的關聯(lián)，盡管實驗方法不同，本研究也支持這一結論。本研究中，我們將泌尿系其他疾病的尿液標本作為對照組，但值得注意的是有少部分對照組患者的尿液中檢測出了基因甲基化狀態(tài)，然而到目前為止，尚未有相關研究證明在這些疾病中存在NID2和HOXA9基因的甲基化，這可能是由于①尿液收集時存在污染；②存在實驗檢測操作問題；③該疾病有可能并發(fā)膀胱腫瘤，但膀胱腫瘤未得到確診。針對這些不足之處，我們會進一步完善后續(xù)的收集和實驗操作以及對患者進一步的隨訪。

綜上所述，NID2和HOXA9基因甲基化聯(lián)合檢測的診斷價值優(yōu)于單一基因，雙指標聯(lián)合檢測可能成為一種有效的診斷原發(fā)性膀胱腫瘤的方法。目前在臨床診斷方面，膀胱鏡依然是金標準，尿脫落細胞學也是重要的輔助手段，尚未有足夠的證據表明尿液NID2和HOXA9基因甲基化檢測可替代尿脫落細胞學檢測，將來進一步的前瞻性研究若能證明其可行性，這樣就可為患者提供一種舒適、無痛且方便的檢測新方法。