劉暢，洪蘭，金紅花

（1.延邊大學(xué)藥學(xué)院 藥劑學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；3.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 延吉 133000）

心肌纖維化是多種心臟相關(guān)類疾病病情不斷發(fā)展所表現(xiàn)的具有共同特性的病理特征，是引起心室重塑的關(guān)鍵因素，其主要病理表現(xiàn)有心肌僵硬度增加、心肌收縮力下降、冠狀動脈血流儲備降低，甚至引起惡性心律失常和猝死[1]。近年來，針對心肌纖維化的治療主要以西藥為主，不僅會出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，治療效果還不理想。對心肌纖維化的治療，中國傳統(tǒng)中藥可以通過多種途徑抑制心肌成纖維細(xì)胞（cardiacfibroblasts, CFb）增殖及膠原蛋白合成，并且取得了不錯的效果，因此中藥治療心肌纖維化已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

CFb是心臟非心肌細(xì)胞的主要組成，具有保護(hù)和支持心臟主體結(jié)構(gòu)，協(xié)調(diào)心肌的舒縮功能，傳達(dá)心肌細(xì)胞內(nèi)信息等許多重要作用；CFb同時也是心肌纖維化過程中主要的效應(yīng)細(xì)胞，它不僅自身具有較強(qiáng)的增殖分裂的能力，而且還可以合成分泌基質(zhì)蛋白，因此在心臟發(fā)生心肌纖維化的過程中具有重要作用[2]。當(dāng)心臟發(fā)生病理性病變時，CFb在多種因素的作用下發(fā)生增殖，同時還會分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白從而引起心臟間質(zhì)纖維膠原大量合成積聚、膠原組成成分與比例發(fā)生改變、空間結(jié)構(gòu)排列順序發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致心肌纖維化。心肌纖維化的主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重失衡，心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維大量沉積、膠原蛋白濃度明顯升高，其中主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白顯著增多，因此膠原蛋白過量沉積也是導(dǎo)致心肌纖維化的重要因素之一[3-5]。

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）是一種很強(qiáng)生物活性物質(zhì)，是已知的最強(qiáng)縮血管的活性物質(zhì)之一，其可通過中樞和外周機(jī)制，促進(jìn)全身血管收縮、使血壓升高，還可刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶合成和分泌醛固酮，醛固酮也是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中另一重要生物活性物質(zhì)，主要功能是調(diào)節(jié)鈉水重吸收和鉀的排泄。AngⅡ也是目前較公認(rèn)的促心肌纖維化重要因素，可以引起CFb的增殖及膠原蛋白合成明顯增加導(dǎo)致心肌纖維化。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是人體中重要的致纖維化細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖、分化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的生成[6-7]。

五味子酚（schisanhenol, Sal）是從中藥五味子中提取的一類木脂素，是其主要的活性成分之一。具有降血壓、抗氧化、保肝護(hù)肝和免疫調(diào)節(jié)的作用[8-10]。目前尚未報道sal對AngII誘導(dǎo)的CFb增殖的影響及抗心肌纖維化的研究。因此本實驗研究Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖及TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響，來探討Sal抗心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，延邊大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Sal（購自上海原葉生物科技有限公司，批號為PJ0607SA13），AngⅡ（購自浙江嘉興市雅瑪試劑有限公司，批號為MAYA-CR-5721），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Hyclone公司，Pen-Strep、DMEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶均購自美國Gibco公司，DAPI、BSA、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司，Vimentin抗體、TGF-β1抗體及Collagen I、CollagenⅢ抗體購自英國Abcam公司，F(xiàn)ITC的羊抗小鼠IgG抗體、HRP羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ECL顯色液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 全波長酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），371型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠分析成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司），U-RFL-T熒光顯微鏡和IX50倒置顯微鏡（日本Olympus公司），X-15離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司），F(xiàn)D6型生物安全柜（意大利Bioair公司），電泳儀（美國Bio-rad公司），轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CFb的分離與培養(yǎng) 取1～3 d新生SD乳鼠10只，用75%酒精消毒，在無菌條件下開胸取出心臟，置入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS）中，將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織碎塊，用0.25%膠原蛋白酶在37℃水浴下不斷進(jìn)行消化，每10 min收集1次消化懸液，共5次。棄第1次的消化懸液，其余每次收集的消化懸液加入等量的含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止其消化，離心（1 200 r/min，5 min），棄上清液，收集沉淀。再加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)皿中，差速貼壁60 min，去除其他細(xì)胞，待細(xì)胞成長接近95%時，按1∶3傳代培養(yǎng)，實驗采用2～5代細(xì)胞。

1.2.2 CFb的鑒定 將CFb放置在倒置顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)。取1×105個2代CFb接種于放有無菌蓋玻片的6孔板中，2～3 d后取出，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，用PBS洗3次，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚破膜20 min，用PBS洗3次，10% BSA封閉2 h，加入Vimentin抗體，4℃過夜。再用PBS洗3次，避光條件下加入標(biāo)記FITC的山羊抗鼠IgG抗體，室溫放置1 h，最后加入DAPI染細(xì)胞核，20 min后置于熒光顯微鏡下、觀察。

1.2.3 MTT法測定CFb的增殖情況 將處在對數(shù)生長期的CFb以每孔0.5×104個接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h后換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使細(xì)胞進(jìn)入生長靜止期，之后給予相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗分組如下：①對照組，無血清的DMEM培養(yǎng)基；②模型組，含AngⅡ 100 nmol/L；③Sal組，含AngⅡ 100 nmol/L的Sal 3個劑量組（100、200及400 μmol/L）。之后每孔加MTT 20 μl（5 mg/ml），培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加150 μl的DMSO，用酶聯(lián)免疫儀在490 nm波長處檢測光密度值（OD值）。細(xì)胞抑制率=（模型組OD值-Sal組OD值）/（模型組OD值-對照組OD值）×100%。

1.2.4 Western blot檢測目的蛋白 將CFb接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后按實驗要求加入處理因素，Sal組中Sal濃度分別為200、600及1 000 μmol/L，其他條件不變，處理時間為24 h。收集處理后的CFb，棄培養(yǎng)液，用少量PBS洗1次，每孔100 μl加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，目標(biāo)蛋白按BCA蛋白試劑盒的說明書操作進(jìn)行蛋白定量，加入4×上樣緩沖液，100℃加熱3 min使蛋白變性。目標(biāo)蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，選取目標(biāo)條帶，用5%脫脂奶粉封閉液進(jìn)行室溫封閉1 h，用PBST洗膜3次，每次10 min，然后分別加入Collagen I抗體、Collagen Ⅲ抗體、TGF-β1抗體，4℃過夜，用PBST洗滌后加入羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體，室溫孵育2 h。分別進(jìn)行Western blot分析，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠圖像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值，并以β-actin為內(nèi)參標(biāo)化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差分析中的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFb形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，CFb的形態(tài)獨(dú)特，呈長梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞的中央有卵圓核，細(xì)胞胞質(zhì)向外伸出突起，有的細(xì)胞呈交叉重疊生長，無自發(fā)性搏動。見圖1A、B。

2.2 CFb免疫熒光鑒定情況

在熒光顯微鏡下觀察，視野中的細(xì)胞綠色部分為Vimentin抗體的顯色，藍(lán)色部分為DAPI染色的非特異細(xì)胞核分布情況。Vimentin抗體表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目的95%以上。見圖2。

圖1 CFb的形態(tài)觀察

圖2 CFb免疫熒光鑒定

2.3 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖的影響

MTT法檢測Sal對AngⅡ誘導(dǎo)CFb增殖的影響，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組OD值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3個不同劑量Sal組的OD值與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

2.4 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFbⅠ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

各組的Collagen I表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=163.962，P=0.000），各組的Collagen I表達(dá)水平有差異。對照組Collagen I條帶較細(xì)，與對照組比較，模型組、AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組的Collagen I灰度值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AngⅡ+1000μmol/L Sal組的Collagen I蛋白表達(dá)無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組Collagen I灰度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

附表 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖的影響 （n =6，±s）

附表 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFb增殖的影響 （n =6，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 OD值 抑制率/%對照組 0.225±0.024 -模型組 0.546±0.0291） -Sal組 100 μmol/L 0.491±0.0482） 17.134 Sal組 200 μmol/L 0.438±0.0292） 33.644 Sal組 400 μmol/L 0.345±0.0222） 62.617 F值 131.365 P值 0.000

各組的Collagen Ⅲ表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=159.517，P=0.000），各組的Collagen Ⅲ表達(dá)水平有差異。對照組Collagen Ⅲ條帶較細(xì)，與對照組比較，模型組、AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ灰度值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AngⅡ+1000μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ灰度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的CFb TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

圖3 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響 （n =6，±s）

各組的TGF-β1表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=241.489，P=0.000），各組的TGF-β1表達(dá)水平有差異。對照組TGF-β1條帶較細(xì)，與對照組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ +600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組的TGF-β1灰度值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AngⅡ +1000μmol/L Sal組中 TGF-β1蛋白表達(dá)無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ+1000μmol/L Sal組TGF-β1灰度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Sal對AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1蛋白表達(dá)的影響（n =6，±s）

3 討論

心肌纖維化是心臟發(fā)生病理性病變時，心臟間質(zhì)中的CFb過度增殖分化，細(xì)胞外基質(zhì)膠原過度聚積及膠原蛋白比例失衡為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu)。其中CFb對心肌纖維化有重要作用，主要通過其增殖分化成為肌成纖維細(xì)胞、分泌多種生物活性因子及細(xì)胞外基質(zhì)而引起心肌纖維化。在此過程中，多種因素參與了CFb功能的調(diào)節(jié)。

在倒置顯微鏡下筆者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓核，此形態(tài)為CFb特有形態(tài)。Vimentin是鑒定成纖維細(xì)胞的主要生物標(biāo)志物；Vimentin抗體的陽性表達(dá)在圖中顯色成綠色，非特異性細(xì)胞核染色為藍(lán)色，經(jīng)觀察CFb細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的95%以上，證實本實驗分離的細(xì)胞為純化的CFb。

本MMT實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組平均OD值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明AngⅡ作為公認(rèn)的促心肌纖維化生物因子，濃度為100 nmol/L時可以促進(jìn)CFb增殖。Sal各劑量組對AngⅡ所致的CFb增殖均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。

CFb分泌的細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原、糖蛋白、蛋白酶、細(xì)胞因子及生長因子等構(gòu)成。其中的膠原主要是Ⅰ型和Ⅲ型，分別約占80%和10%，主要功能是支撐心臟整體骨架、傳遞信號到心肌細(xì)胞、調(diào)節(jié)心臟有規(guī)律收縮[11]。本結(jié)果顯示，與對照組比較，藥物處理24 h后，模型組的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)量增加。說明100 nmol/L的AngⅡ不僅可以促進(jìn)CFb的增殖，還可以促進(jìn)由CFb分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成。在Sal組中，不同濃度的Sal能抑制AngⅡ誘導(dǎo)后的CFb中Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)；此外還發(fā)現(xiàn)，Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的變化趨勢與其有一定的相關(guān)性。說明Sal可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)后CFb分泌的細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白合成。

TGF-β1是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞因子，它不僅參與正常機(jī)體組織代謝和功能維持，還在多種疾病病理生理過程中發(fā)揮重要作用。同時TGF-β1又是一類多效應(yīng)的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖、分化；促進(jìn)合成膠原蛋白的合成；抑制膠原的降解，同時對膠原酶原、基質(zhì)酶原等產(chǎn)生抑制作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在藥物處理24 h后，模型組中TGF-β1蛋白表達(dá)升高。說明在CFb中AngⅡ可以促進(jìn)TGF-β1蛋白表達(dá)，而且TGF-β1蛋白量增加與CFb的增殖及膠原蛋白合成有關(guān)。初步證實TGF-β1相關(guān)信號通路參與了AngⅡ誘導(dǎo)新生大鼠心臟纖維化的過程。Sal可以下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)后CFb中TGF-β1蛋白表達(dá)且呈一定的劑量依賴性。

筆者通過以上研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導(dǎo)下，CFb中的TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)升高，其作用機(jī)制可能是AngⅡ誘導(dǎo)CFb合成TGF-β1，生成的TGF-β1反過來刺激CFb合成Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，大量的CFb增殖及細(xì)胞外基質(zhì)堆積導(dǎo)致心肌纖維化。在Sal干預(yù)的蛋白表達(dá)中，TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白降低且表達(dá)呈正相關(guān)。因此TGF-β1與ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白之間存在著相互調(diào)節(jié)關(guān)系。提示Sal對AngⅡ誘導(dǎo)CFb的增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的抑制作用部分是通過下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)而實現(xiàn)的。

綜上所述，Sal能抑制CFb增殖及降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，而起到了抗心肌纖維化的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。阻斷TGF-β1有可能成為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的一個重要靶點(diǎn)。