朱永香　王倩　徐燕

[摘要]目的 觀察催產(chǎn)素（OT）在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用。方法 選取48只雄性SD大鼠，將其中16只隨機(jī)分為自由攝食組與禁食72 h組，每組各8只，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠杏仁核內(nèi)OT受體的表達(dá)。剩余32只大鼠行杏仁核內(nèi)套管植入術(shù)，術(shù)后將其中16只大鼠隨機(jī)分為兩組，分別為杏仁核內(nèi)注射OT組及杏仁核內(nèi)注射生理鹽水1組，每組各8只，分別檢測大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量；另外16只術(shù)后大鼠隨機(jī)分為兩組，分別為杏仁核內(nèi)注射催產(chǎn)素受體阻斷劑（Atosiban）組及杏仁核內(nèi)注射生理鹽水2組，每組各8只，分別檢測大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量。結(jié)果 禁食72 h組大鼠的杏仁核內(nèi)OT受體表達(dá)高于正常攝食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；杏仁核內(nèi)注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量低于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；杏仁核內(nèi)注射Atosiban大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量高于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 OT在杏仁核內(nèi)通過作用于其受體參與了攝食的調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞]催產(chǎn)素；杏仁核；催產(chǎn)素受體阻斷劑；攝食

[中圖分類號(hào)] R395.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）8（a）-0004-04

Regulation of Oxytocin on feeding in the amygdaloid nucleus

ZHU Yong-xiang WANG Qian XU Yan YU Wei NAN Ying CAO Jian

Teaching and Research Room of Physiology， Department of Basic Medicine， Xi'an Medical University， Shanxi Province， Xi'an 710021， China

[Abstract] Objective To observe the regulation of Oxytocin （OT） on feeding in the amygdaloid nucleus. Methods Forty-eight male Sprague-Dawley （SD） rats were selected. Among them， 16 rats were randomly divided into free-feeding group and 72-hour fasted group， with 8 in each group. Immunohistochemistry was used to detect the expression of OT receptors in the rat amygdala. The remaining 32 rats were subjected to cannula implantation in amygdala and 16 of them were randomly divided into two groups， namely the injected with OT in amygdaloid nucleus group and the injected with normal saline in amygdaloid group 1 respectively， 8 rats in each group. Food intake was measured in rats at 0.5， 1， 2， and 3 h. Another 16 postoperative rats were randomly divided into two groups， namely the injected with OT receptor blocker （Atosiban） in amygdaloid nucleus group and the injected with normal saline in amygdaloid group 2 respectively， 8 rats in each group. Similarly， food intake of the rats was measured at 0.5， 1， 2， and 3 h. Results The expression of OT receptors in the amygdaloid nucleus of rats in the 72-hour fasted group was significantly higher than that in the normal feeding group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The food intake of rats of injected with OT in amygdaloid nucleus group at 0.5， 1， 2， and 3 h were lower than those in the injected with normal saline in amygdaloid group 1， and the differences were statistically significant （P<0.05）.The food intake of rats of injected with Atosiban in amygdaloid nucleus group at 0.5， 1， 2， and 3 h were higher than those in the injected with normal saline in amygdaloid group 2， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion OT participates in feeding regulation in the amygdaloid nucleus through acting on its receptors.

[Key words] Oxytocin； Amygdaloid nucleus； Atosiban； Food intake

催產(chǎn)素（Oxytocin，OT）是由下丘腦室旁核及視上核神經(jīng)元合成的一種激素，部分OT通過神經(jīng)元軸突運(yùn)輸至神經(jīng)垂體儲(chǔ)存，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，將在此處被分泌至循環(huán)系統(tǒng)。下丘腦室旁核內(nèi)合成OT的部分神經(jīng)元軸突投射至其他腦區(qū)，如下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核、杏仁核、內(nèi)側(cè)和外側(cè)隔核、海馬背側(cè)及腹側(cè)、藍(lán)斑核、孤束核、迷走神經(jīng)背運(yùn)動(dòng)核等。OT受體廣泛分布在與食欲調(diào)控相關(guān)的腦區(qū)，如杏仁核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核以及孤束核等。

OT的主要生理作用是在孕婦分娩過程中，促進(jìn)子宮強(qiáng)烈收縮加速產(chǎn)程，在婦女哺乳期間，促進(jìn)乳腺排出乳汁。然而，近年來的研究表明，OT具有強(qiáng)烈的抑制動(dòng)物攝食及降低體重的作用[1-4]。厭食癥患者的發(fā)病機(jī)制與OT對攝食的調(diào)控有關(guān)[5]。正常人鼻腔給予OT后，食物的攝入量明顯減少，而肥胖患者鼻腔給予OT后，體重會(huì)明顯降低，并未出現(xiàn)顯著的副作用[6-8]。因此，OT有可能成為人類肥胖防治的一種新藥。但關(guān)于OT抑制攝食的中樞機(jī)制研究還不明確。杏仁核是邊緣前腦中與攝食調(diào)控關(guān)系密切的核團(tuán)之一。杏仁核內(nèi)既有OT神經(jīng)纖維的投射，也有OT受體的分布，那么，有理由推測，OT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用可能與杏仁核的攝食調(diào)控作用密切相關(guān)。因此，本研究檢測了大鼠能量攝入不足時(shí)，OT受體在杏仁核內(nèi)的表達(dá)變化，探索杏仁核內(nèi)OT受體在能量攝入調(diào)節(jié)中的作用；大鼠杏仁核內(nèi)注射OT，檢測大鼠攝食量的變化，探索外源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用；最后，大鼠杏仁核內(nèi)注射催產(chǎn)素受體阻斷劑（Atosiban），檢測大鼠攝食量的變化，探索內(nèi)源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用，本研究旨在為闡明OT對攝食調(diào)控的中樞機(jī)制提供創(chuàng)新性研究資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的健康、活潑的48只雄性Sprague-Dawly（SD）大鼠，初始體重220～250 g。所有大鼠均分籠喂養(yǎng)，采用顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用自來水，室溫21～25℃。

1.2主要儀器與試劑

主要試劑：OT及Atosiban（美國Sigma公司），兔抗催產(chǎn)素受體抗體（Santa Cruz公司），DAB試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司），羊抗兔SP試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：光學(xué)顯微鏡（Olympus，BX51），大鼠腦立體定位儀（日本NARISHIGE公司，SN-3）及圖像分析軟件（Image-Pro Plus）等。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.3.1禁食對杏仁核內(nèi)催產(chǎn)素受體表達(dá)的影響 從48只SD大鼠中選取16只，將其隨機(jī)分為兩組，分別為自由攝食組與禁食72 h組，每組各8只。自由攝食組大鼠自由攝食，禁食72 h組大鼠禁食72 h，大鼠腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，將插管經(jīng)左心室插入主動(dòng)脈內(nèi)并固定，100 ml生理鹽水迅速灌流，450 ml多聚甲醛固定液（40 g/L）繼續(xù)灌流約2 h。取鼠腦置于4℃固定液4～6 h，再移入蔗糖溶液（200 g/L）約12 h。取出鼠腦做冰凍切片，厚度約40 μm，0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗腦片。0.3%（ml/L）的H2O2孵育腦片30 min，洗腦片每次5 min，共3次，正常山羊血清封閉60 min。將腦片置入4℃兔抗大鼠OT受體抗體（1：300）孵育36 h，PBS沖洗，移入羊抗兔IgG（1：300）中1 h，PBS沖洗。移入S-A/HRP中1 h，PBS沖洗。DAB顯色，將腦片裱于載玻片上，自然晾干后，酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.3.2杏仁核內(nèi)植入不銹鋼套管術(shù) 剩余32只SD大鼠行杏仁核內(nèi)套管植入術(shù)。將其腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）麻醉后，固定于鼠腦立體定位儀上，將不銹鋼套管植入大鼠左側(cè)杏仁核上方2.0 mm處（前囟后2.4 mm，向左旁開4.1 mm，硬腦膜下5.0 mm）植入套管，將3個(gè)不銹鋼小螺絲固定于顱骨上，牙科水泥固定套管。術(shù)后大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素（每只20萬單位/次）預(yù)防感染，待大鼠傷口痊愈、狀態(tài)良好時(shí)開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3外源性催產(chǎn)素注射至杏仁核內(nèi)對攝食量的影響 將16只術(shù)后痊愈的大鼠隨機(jī)分為兩組，每組各8只。其中一組大鼠食物撤去24 h后，采用微量注射器予大鼠杏仁核內(nèi)注射生理鹽水（杏仁核內(nèi)注射生理鹽水1組），另一組大鼠杏仁核內(nèi)注射OT 10 μg（杏仁核內(nèi)注射OT組）。分別檢測兩組大鼠0.5、1、2及3 h內(nèi)的攝食量。注射時(shí)，微量注射器針尖在套管下方2.0 mm處，注射時(shí)間持續(xù)2 min，注射完畢后，注射器要停留在杏仁核內(nèi)2 min。

1.3.4杏仁核內(nèi)注射催產(chǎn)素受體阻斷劑對攝食量的影響 將另外16只術(shù)后痊愈的大鼠隨機(jī)分為兩組，每組各8只。其中一組大鼠食物撤去24 h后，采用微量注射器予大鼠杏仁核內(nèi)注射生理鹽水（杏仁核內(nèi)注射生理鹽水2組），另一組大鼠杏仁核內(nèi)注射Atosiban 20 μg（杏仁核內(nèi)注射Atosiban組）。分別檢測以上兩組大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量。注射時(shí)，微量注射器針尖在套管下方2.0 mm處，注射時(shí)間持續(xù)2 min，注射完畢后，注射器要停留在杏仁核內(nèi)2 min。

1.3.5杏仁核定位 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，經(jīng)套管注射旁胺天藍(lán)，注射完畢后微量注射器停留2 min，將大鼠灌流固定，斷頭取腦，將鼠腦放入10%多聚甲醛中固定約1 d，取鼠腦做冰凍切片，厚度40 μm，中性紅染色，酒精脫水，二甲苯透明，對照大鼠腦定位圖譜，10×10光鏡下觀察注射位置，位置不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)排除實(shí)驗(yàn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1禁食72 h組與正常攝食組大鼠杏仁核內(nèi)OT受體表達(dá)的比較

光鏡下杏仁核內(nèi)OT受體陽性神經(jīng)元的細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色顆粒。自由攝食組大鼠杏仁核內(nèi)OT受體陽性神經(jīng)元染色較淺，平均光密度值為0.3015±0.0127；禁食72 h組大鼠杏仁核內(nèi)OT受體免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元染色較深，平均光密度值為0.4102±0.0305。禁食72 h組大鼠的杏仁核內(nèi)OT受體表達(dá)高于正常攝食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.2杏仁核內(nèi)注射OT組與注射生理鹽水1組大鼠不同時(shí)間攝食量的比較

杏仁核內(nèi)注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量均低于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3杏仁核內(nèi)注射Atosiban組與注射生理鹽水2組大鼠不同時(shí)間攝食量的比較

杏仁核內(nèi)注射Atosiban大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量均高于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

OT是由9個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)激素，能夠促進(jìn)分娩過程中孕婦子宮強(qiáng)烈收縮從而加速產(chǎn)程，也可促進(jìn)哺乳期婦女乳腺排出乳汁。另外，OT還與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[9]，并參與社會(huì)認(rèn)知過程[10-11]，也參與體液平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制[12]。然而，最近的研究熱點(diǎn)集中在OT對攝食的調(diào)節(jié)作用[13-14]。大鼠側(cè)腦室或外周注射OT均呈劑量依賴性地減少攝食、降低體質(zhì)量。人體鼻腔內(nèi)給予OT可抑制獎(jiǎng)賞驅(qū)動(dòng)的食物攝入[6]。厭食癥患者外周OT水平明顯升高，導(dǎo)致其食欲降低。相反，普拉德威利綜合癥患者下丘腦室旁核內(nèi)表達(dá)OT的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，導(dǎo)致其攝食過多，出現(xiàn)病態(tài)肥胖。最近研究顯示，兒童肥胖與OT受體多態(tài)性有關(guān)[15]。以上研究表明，OT對動(dòng)物及人類均具有明顯抑食及降低體質(zhì)量的作用，并與人類營養(yǎng)代謝異常疾病密切相關(guān)，因此，OT可能成為人類營養(yǎng)代謝異常疾病防治的一種新藥。

由于OT神經(jīng)元軸突投射至大腦的多個(gè)區(qū)域，這些區(qū)域既參與攝食的獎(jiǎng)賞機(jī)制，也參與能量平衡的調(diào)節(jié)作用，因此，OT對攝食調(diào)節(jié)的機(jī)制是復(fù)雜的[16]。研究證實(shí)OT在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核對攝食具有抑制作用[17]，提示OT在下丘腦內(nèi)可能參與能量平衡的調(diào)控機(jī)制。OT在腹側(cè)被蓋區(qū)和伏核能抑制可口性食物的攝入[18-19]，提示OT可通過抑制獎(jiǎng)賞作用減少食物攝入。最近有研究指出，OT可通過增強(qiáng)人類認(rèn)知控制能力抑制食物的攝入[20]。杏仁核是邊緣前腦中與攝食行為調(diào)控關(guān)系密切的核團(tuán)之一。神經(jīng)肽Y、胃促生長素等在杏仁核內(nèi)均具有調(diào)節(jié)攝食的作用。杏仁核內(nèi)既有OT神經(jīng)纖維末梢的投射，也有OT受體的分布，由此推測，OT在杏仁核內(nèi)可能同樣參與攝食的調(diào)控過程。

為確定催產(chǎn)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用是否與杏仁核有關(guān)，本研究選取其中一組大鼠禁食72 h，減少大鼠的能量攝入，檢測催產(chǎn)素受體在杏仁核內(nèi)的表達(dá)變化。本研究結(jié)果提示，禁食72 h組大鼠的杏仁核內(nèi)OT受體表達(dá)高于正常攝食組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這是由于能量攝入不足時(shí)，下丘腦室旁核內(nèi)OT的合成和釋放減少，運(yùn)輸至杏仁核的OT也相應(yīng)減少，從而導(dǎo)致OT受體在杏仁核內(nèi)的表達(dá)上調(diào)，提示杏仁核內(nèi)的OT受體參與大鼠攝食調(diào)節(jié)的過程。

為確定OT在杏仁核內(nèi)對攝食調(diào)節(jié)的直接作用，本研究給兩組禁食24 h大鼠杏仁核內(nèi)分別注射外源性O(shè)T和生理鹽水，于0.5、1、2、3 h內(nèi)檢測大鼠的攝食量。結(jié)果提示，杏仁核內(nèi)注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)的攝食量低于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示外源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對攝食具有抑制作用，并且其減少攝食的作用起效較快，持續(xù)時(shí)間也比較長，之后應(yīng)進(jìn)一步延長觀察時(shí)間，以檢測OT在杏仁核內(nèi)對攝食抑制作用的最長持續(xù)時(shí)間。

為確定內(nèi)源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用，本研究給兩組禁食24 h大鼠杏仁核內(nèi)分別注射20 μg Atosiban和生理鹽水，于0.5、1、2、3 h內(nèi)檢測大鼠的攝食量。結(jié)果提示，杏仁核內(nèi)注射Atosiban的大鼠0.5、1、2、3 h內(nèi)攝食量高于杏仁核內(nèi)注射生理鹽水2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示Atosiban與OT競爭占據(jù)了杏仁核內(nèi)的OT受體，從而阻斷內(nèi)源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致大鼠攝食量增多。由此推測，內(nèi)源性O(shè)T在杏仁核內(nèi)對大鼠的攝食具有抑制性調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究將OT對攝食的調(diào)節(jié)作用與杏仁核對攝食的調(diào)節(jié)作用關(guān)聯(lián)起來，為OT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用提供了新的研究資料，但OT在杏仁核內(nèi)對攝食的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，未來應(yīng)進(jìn)一步研究OT在杏仁核內(nèi)對攝食的調(diào)節(jié)作用是否與味覺感受、情緒反應(yīng)以及杏仁核內(nèi)調(diào)節(jié)攝食的其他激素或神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ho JM，Blevins JE.Coming full circle：contributions of central and peripheral oxytocin actions to energy balance[J].Endocrinology，2013，154（2）：589-596.

[2]Noble EE，Billington CJ，Kotz CM，et al.Oxytocin in the ventromedial hypothalamic nucleus reduces feeding and acutely increases energy expenditure[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2014，307（6）：R737-R745.

[3]Blevins JE，Ho JM.Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight[J].Rev Endocr Metab Disord，2013，14（4）：311-329.

[4]Roberts ZS，Wolden-Hanson TH，Matsen ME，et al.Chronic hindbrain administration of oxytocin is sufficient to elicit weight loss in diet-induced obese rats[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2017，313（4）：R357-R371.

[5]J Russel，S Maguire，GE Hunt，et al.Intranasal oxytocin in the treatment of anorexia nervosa：Randomized controlled trial during re-feeding[J].Psychoneuroendocrinology，2017，（87）：83-92.

[6]Ott V，F(xiàn)inlayson G，Lehnert H，et al.Oxytocin reduces reward-driven food intake in humans[J].Diabetes，2013，62（10）：3418-3425.

[7]Zhang H，Wu C，Chen Q，et al.Treatment of obesity and diabetes using oxytocin or analogs in patients and mouse models[J].Plos One，2013，8（5）：e61477.

[8]Thienel M，F(xiàn)ritsche A，Heinrichs M，et al.Oxytocin's inhibitory effect on food intake is stronger in obese than normal-weight men[J].Int J Obes（Lond），2016，40（11）：1707-1714.

[9]Lee JH，Zhang JY，Wei ZZ，et al.Impaired social behaviors and minimized oxytocin signaling of the adult mice deficient in the N-methyl-d-aspartate receptor GluN3A subunit[J].Exp Neurol，2018，（305）：1-12.

[10]Kis A，Hernádi A，Miklósi B，et al.The way dogs（Canis familiaris）look at human emotional faces is modulated by oxytocin.An Eye-Tracking Study[J].Front Behav Neurosci，2017，（11）：210.

[11]Plessow F，Marengi DA，Perry SK，et al.Effects of intranasal oxytocin on the blood oxygenation level-dependent signal in food motivation and cognitive control pathways in overweight and obese Men[J].Neuropsychopharmacology，2018， 43（3）：638-645.

[12]Ryan PJ，Ross SI，Campos CA，et al.Oxytocin-receptor-expressing neurons in the parabrachial nucleus regulate fluid intake[J].Nat Neurosci，2017，20（12）：1722-1733.

[13]Skinner JA，Garg ML，Dayas CV，et al.Relationship between dietary intake and behaviors with oxytocin：a systematic review of studies in adults[J].Nutr Rev，2018，76（5）：303-331.

[14]Lawson EA.The effects of oxytocin on eating behaviour and metabolism in humans[J].Nat Rev Endocrinol，2017，13（12）：700-709.

[15]Bush NR，Allison AL，Miller AL，et al.Socioeconomic disparities in childhood obesity risk：association with an oxytocin receptor poly-morphism[J].JAMA Pediatr，2017，（171）：61-67.

[16]Maejima Y，Yokota S，Nishimori K，et al.The anorexigenic neural pathways of oxytocin and its clinical implication[J].Neuroendocrinology，2018，107（1）：489263.

[17]Kockars OA，Waas JR，Klockars A，et al.Neural basis of ventromedial hypothalamic oxytocin-driven decrease in appetite[J].Neuroscience，2017，（366）：54-61.

[18]Mullis K，Kay K，Williams DL.Oxytocin action in the ventral tegmental area affects sucrose intake[J].Brain Res，2013， 1513（23）：85-91.

[19]Herisson FM，Waas JR，F(xiàn)redriksson R，et al.Oxytocin acting in the nucleus accumbens core decreases food intake[J].Jneuroendocrinol，2016，28（4）：12381.

[20]Spetter MS，F(xiàn)eld GB，Thienel M，et al.Oxytocin curbs calorie intake via food-specific increases in the activity of brain areas that process reward and establish cognitive control[J].Sci Rep，2018，8（1）：2736.

（收稿日期：2018-05-09 本文編輯：孟慶卿）