王宇洲, 馬 銳, 向 杰, 陳敬師, 李世貴, 龔明波, 顧金剛*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集保藏重點實驗室, 北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室, 北京 100081

脂肪酶(EC 3.1.1.3)被認為是最重要的商業(yè)酶之一，可在油水界面上催化甘油三酯水解釋放甘油二酯、長鏈脂肪酸(>8碳)和甘油[1]。在水解過程中，脂肪酶與甘油?；Y(jié)合形成脂肪酶酰基復(fù)合物，然后將酰基轉(zhuǎn)移到水的-OH上;而在非水性催化條件下，脂肪酶將羧酸酰基轉(zhuǎn)移至親核化合物上[2]。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似性，脂肪酶屬于α/β水解酶家族，其中催化三聯(lián)體(通常為絲氨酸、組氨酸、谷氨酸或天冬氨酸)和氧離子空穴是催化反應(yīng)的關(guān)鍵[3]，此外，蓋子結(jié)構(gòu)、底物親和性也與活性位點的結(jié)合能力有著緊密關(guān)系。

脂肪酶廣泛存在于微生物、植物和動物中，其中，細菌脂肪酶、真菌脂肪酶因具有產(chǎn)量高、易操作等特點，一直是研究和應(yīng)用的重點。研究表明，細菌和酵母來源的脂肪酶可在高溫下保持較高的酶活力，如來源于Pseudomonasaeruginosa、嗜熱芽孢桿菌(Bacillusthermophilus)和酵母(Kurtzmanomycessp.)的脂肪酶，最適溫度在60～75℃[4,5]。

木霉(Trichoderma)具有顯著的木質(zhì)纖維素降解能力，能產(chǎn)生多種水解酶、裂解酶和輔助酶，包括纖維素酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、漆酶、脂肪酶等[6]，而且木霉是酶制劑產(chǎn)業(yè)的重要表達系統(tǒng)之一[7]。目前，已完成了13株木霉菌株的基因組測序[8,9]，其中綠色木霉[10]、里氏木霉[11]、哈茨木霉[12]和T.gamsii[13]的基因組序列分析結(jié)果表明，木霉普遍具有多個脂肪酶基因[14]。本課題組在前期研究中篩選獲得了1株脂肪酶酶活力較高的木霉菌株T.lentiformeACCC30425[15]，本研究依據(jù)該菌株的全基因組測序結(jié)果，注釋了15個脂肪酶基因，以此進行基因合成和原核異源表達，并對脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究，以期為耐熱脂肪酶的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌感受態(tài)細胞EscherichiacoliTransI和BL21(DE3)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pET-30a(+)載體購于美國Invitrogen公司。

1.2 溶劑和底物配制

異丙基硫代β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素、LB培養(yǎng)基等配制方法均參考孫喬喬等[16]的配方。

底物配制：A液：取固體對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-nitrophenylpalmitate，pNPP)8 mmol溶解于10 mL異丙醇中，溫?zé)崛芙?，?℃保存，有效期為1周；B液：用蒸餾水配制20 mmol/L Tris，加0.22 g阿拉伯膠，用鹽酸調(diào)至pH 8(視具體情況而定)，于4℃保存，有效期為1周。按照1∶9的比例混合A液和B液，制成底物溶液。

1.3 脂肪酶基因分析

利用KOG/KEGG/GO數(shù)據(jù)庫對全基因組測序結(jié)果進行注釋，獲得脂肪酶基因。再利用Vector NTI 10軟件(美國Invitrogen公司)對cDNA序列進行翻譯并獲得推導(dǎo)氨基酸序列，分析等電點和蛋白質(zhì)分子量，然后利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)線上軟件預(yù)測信號肽長度，最后利用BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析序列相似性。同時，利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)完成預(yù)測脂肪酶的同源建模以及與PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中序列的比對，并采用MEGA 6和ClustalX 1.81構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行蛋白質(zhì)聚類分析。

1.4 脂肪酶基因合成與原核表達

根據(jù)ACCC30425全基因組序列，經(jīng)數(shù)據(jù)庫注釋獲得了15個脂肪酶基因cDNA，以此為基礎(chǔ)，手動刪除信號肽，選擇合適酶切位點，刪除原有終止密碼子，將所需合成的成熟肽鏈的DNA序列信息交至上海捷瑞生物工程有限公司，以合成密碼子優(yōu)化的適合原核表達的核苷酸序列。對合成產(chǎn)物以及pET30a(+)質(zhì)粒進行EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切后，使用T4 DNA連接酶進行連接(20℃過夜)。將連接產(chǎn)物pET30a(+)-lip熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，獲得pET30a(+)-lip-BL21，挑單菌落驗證陽性克隆。再利用IPTG誘導(dǎo)菌株表達，并通過超聲波破碎獲得脂肪酶粗酶液[16]。

1.5 重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.5.1pNPP法測定脂肪酶酶活力 按照pNPP法測定脂肪酶酶活力，于37℃反應(yīng)15 min后，加入2 mL無水乙醇終止反應(yīng)，隨后12 000 r/min離心2 min取上清液，于410 nm處測定吸光度(OD值)，進而計算重組脂肪酶的活性[15]。1個脂肪酶活性單位(U)定義為在一定的反應(yīng)條件下，每分鐘分解pNPP生成1 μmoL對硝基酚(p-Nitrophenol，pNP)所需的脂肪酶酶量[16]。

1.5.2酶學(xué)性質(zhì)分析 酶活粗篩：按照1.5.1分別測定重組酶酶活力。

最適反應(yīng)pH：保持A液不變，用不同pH(7.0、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0)的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液配制B液。其他步驟同1.5.1。

最適反應(yīng)溫度：在酶的最適pH條件下，于不同溫度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃和95℃)中測定酶活力。其他步驟同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶基因分析

經(jīng)T.lentiformeACCC30425基因組序列分析，共注釋獲得15個脂肪酶編碼基因(表1)。Vector NTI 10軟件分析結(jié)果表明菌株ACCC30425的脂肪酶分子量在55～70 kDa之間，其中ACCC30425_8519基因編碼的脂肪酶分子量最大，高達68.8 kDa，而ACCC30425_5744編碼的脂肪酶分子量最小。脂肪酶的等電點處于4.0～6.0之間。SignalP線上軟件確定所有脂肪酶均為胞外分泌。

基于Swissprot數(shù)據(jù)庫的Blast比對，有11個脂肪酶與已知序列的相似性低于50%，其中有5個低于40%；而于PDB數(shù)據(jù)庫中序列比對，有10個脂肪酶與已知序列的相似性低于40%，其中有3個低于30%。結(jié)合2個數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，有5個脂肪酶基因(表1中下劃線標注)在酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)比對方面都具有一定的新穎性。

2.2 T. lentiforme ACCC30425脂肪酶的聚類分析

將T.lentiformeACCC30425的15個脂肪酶基因與相似序列以最大相似法構(gòu)建聚類關(guān)系樹(圖1)。結(jié)果表明，菌株ACCC30425的脂肪酶與哈茨木霉(T.harzianum)和貴州木霉(T.guizhouense)來源的脂肪酶的同源性更高，其中脂肪酶ACCC30425_2714更接近于T.lixii來源的脂肪酶。

2.3 T. lentiforme ACCC30425重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

T.lentiformeACCC30425的15個脂肪酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后分別與載體pET30a(+)連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中表達。

2.3.1脂肪酶酶活力篩選 按照1.5.1測定重組脂肪酶酶活力，結(jié)果表明，共有11個陽性克隆產(chǎn)脂肪酶，分別為LipA、LipB、LipC、LipD、LipH、LipI、LipK、LipL、LipM、LipP、LipQ，具體酶活力見表2。其中，LipP、LipK、LipH、LipM、LipQ、LipD的酶活力均高于0.1 U/mL，LipB的酶活最低，而其他4個克隆未產(chǎn)脂肪酶。

表1 Trichoderma lentiforme ACCC30425的脂肪酶基因分析Table 1 Analysis of the lipase genes from Trichoderma lentiforme ACCC30425.

圖1 T. lentiforme ACCC30425脂肪酶的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of the lipases from T. lentiforme ACCC30425.

2.3.2最適反應(yīng)pH 在37℃、不同pH條件下測定T.lentiformeACCC30425重組脂肪酶酶活力。如圖2所示，LipB最適pH為8.5，LipA、LipH最適pH為9.0，而LipC、LipD、LipI、LipK、LipL、LipM、LipP和LipQ的最適pH均為9.5。當pH<8.5時，LipL失去活性；當pH>10.0時，LipA和LipB的相對活性低于60%;而其他脂肪酶均保持著60%以上的相對活性。因此，T.lentiformeACCC30425脂肪酶普遍具有耐堿性，即在堿性條件下可保持較高的酶活力。

表2 重組脂肪酶活性Table 2 Activities of recombinant lipases.

圖2 pH對Trichoderma lentiforme ACCC30425重組脂肪酶酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on the activities of recombinant lipases from Trichoderma lentiforme ACCC30425.A:具有特性的酶LipA、LipB、LipH；B:性質(zhì)相近的酶LipC、LipI、LipM、LipP;C：性質(zhì)相近的酶LipD、LipK、LipL、LipQ。

2.3.3最適反應(yīng)溫度 在最適pH、不同溫度的條件下測定脂肪酶酶活力。結(jié)果如圖3所示，LipQ為中溫酶，最適溫度為50℃，當溫度高于60℃時，其酶活力急劇下降。其他脂肪酶均屬高溫脂肪酶，最適溫度在70～90℃。其中，LipP的最適溫度為90℃，且在中溫環(huán)境也保持50%以上的相對活性；LipA、LipL的最適溫度為70℃；而其他脂肪酶的最適溫度均為80℃。

2.3.4最適條件下測定酶活力 如圖4所示，重組脂肪酶在最適條件下的酶活力，相較于標準條件均有明顯提高。如在標準條件下酶活力最低的LipB，在最適條件下其酶活力提高了87倍；LipP酶活力仍為最高，在最適條件下其酶活力提高了8倍，高達1.5 U/mL。最適溫度為80℃的脂肪酶在最適條件下的酶活力普遍在0.8～1.2 U/mL范圍內(nèi)。

3 討論

篩選具有特殊性質(zhì)的脂肪酶一直備受研究領(lǐng)域和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)注，微生物來源的脂肪酶最適溫度普遍在30～50℃之間，溫度過高會導(dǎo)致脂肪酶結(jié)構(gòu)變性至失活，國內(nèi)單志文等[17]在2001年首次篩選到1個來源于Pseudomonasfragi的脂肪酶，其最適溫度為65～70℃，具有耐熱性。

在實際應(yīng)用中，脂肪酶參與的工業(yè)催化反應(yīng)過程大多需要較高的反應(yīng)溫度，尤其是替代化石能源的生物柴油的生產(chǎn)工藝的研究。近年來，人們一直在挖掘耐熱以及超耐熱酯酶/脂肪酶，通常是先在熱泉和籠屜等高溫環(huán)境下篩選嗜熱菌株，再對嗜熱微生物中的脂肪酶基因進行克隆、異源表達，亦或構(gòu)建突變體，從而改良酶學(xué)性質(zhì)，如來自嗜熱細菌[18]、短梗霉[19]、假單胞菌[20]、芽孢桿菌[21,22]等嗜熱微生物[23]的耐熱酯酶/脂肪酶基因重組表達后的最適反應(yīng)溫度往往在60～75℃，此外，來自嗜熱古細菌的酯酶[24]的最適反應(yīng)溫度為90℃，此為迄今國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最適反應(yīng)溫度最高的酯酶，然而超耐熱脂肪酶的研究近來鮮有報道。

圖4 脂肪酶在標準條件酶活和最適反應(yīng)條件下的酶活力Fig.4 The activities of lipases under standard and optimal reaction conditions.

本研究首次報道了基于基因組序列分析的木霉Trichodermalentiforme脂肪酶的系統(tǒng)研究，來源于T.lentiformeACCC30425的脂肪酶LipP最適溫度為90℃，是目前已知的最適反應(yīng)溫度最高的脂肪酶。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了多個具有耐堿性(pH 8.5～9.5)、耐熱性(70～90℃)的脂肪酶，為脂肪酶的基礎(chǔ)研究和潛在應(yīng)用提供了寶貴的材料。這些性質(zhì)各異的木霉脂肪酶具有很好的應(yīng)用前景和開發(fā)潛能，需要通過更加高效的表達系統(tǒng)進行表達和純化，以便在酶學(xué)的結(jié)構(gòu)功能上進行更深一步的研究。