張曉龍, 李立平, 魯仁義, 閻 瀾*, 姜遠英*

1.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心, 上海 200433;2.同濟大學醫(yī)學院, 上海 200092

中藥五倍子(Galla Chinensis)是由五倍子蚜蟲寄生在漆樹科鹽膚木屬(Rhus)植物上形成的蟲癭，具有斂肺降火、澀腸止瀉、斂汗止血、收濕斂瘡等功效。五倍子具有多種生物活性，包括收斂、抗菌、殺精子、抗腫瘤等作用，尤其在抗菌領域具有良好的應用前景[1]。研究表明，五倍子不僅對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌等細菌具有明顯的抑制或殺滅作用，對新生隱球菌、白念珠菌等真菌也有較強的抑制能力[2]。本課題組前期研究結果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)表明，五倍子醇提物對白念珠菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)可達4 μg/mL，即五倍子具有較強的體外抗真菌活性，但其抗真菌的靶蛋白及作用機制并不明確，阻礙了對其抗真菌作用的深入研究。

蛋白質組學的出現(xiàn)為藥物作用靶點的探索與研究提供了一個良好的平臺，研究人員可以通過對整體蛋白質的大規(guī)模分析找出表達和功能發(fā)生改變的蛋白質，從而挖掘藥物發(fā)揮作用的關鍵分子。iTRAQ是一種體外同種同位素標記的相對與絕對定量技術[3]。該技術可同時比較多達8種樣品之間的蛋白表達量差異，具有高通量、高靈敏度、分離能力強、結果可靠等特點，在天然產物抗菌、抗腫瘤分子機制等方面的研究中得到廣泛應用[4]。因此，本研究采用基于iTRAQ的蛋白質組學技術研究經五倍子處理的白念珠菌的差異表達蛋白，并利用生物信息學工具對差異蛋白進行細胞組件、分子功能和生物過程以及參與的信號通路的分析，以期探明五倍子抗白念珠菌可能的靶蛋白及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白念珠菌標準菌株(SC5314)由美國華盛頓喬治敦大學William A. Fonzi教授饋贈。

中藥五倍子購自上海雷允上大藥店；EDTA、DTT、PMSF、leupeptin、pepstatin、antipain等購于美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS電泳液、考馬斯亮藍染色液均購于上海碧云天生物技術有限公司；PAGE凝膠制備試劑盒購于上海雅酶生物科技有限公司；iTRAQ試劑盒購于美國AB SCIEX公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸膏10 g，混勻溶于900 mL三蒸水中，再加入瓊脂18 g，定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，于超凈臺倒入平皿，凝固后置于4℃保存?zhèn)溆?。YPD液體培養(yǎng)基不加瓊脂，其他成分同YPD固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。

1.3 儀器與設備

DL-1000B智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；HZ-2111K-B型恒溫培養(yǎng)箱(太倉實驗設備廠)；Precellys 24 Dual生物樣品均質器(法國Bertin公司)；TripleTOFTM5600質譜儀、Eksigentnano LC-UltraTMsystem(美國AB SCIEX公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1中藥提取 參考吳晶等[5]的方法。將50 g五倍子研磨成粉末，過20目篩，置于1 L圓底磨口燒瓶中，加入250 mL 75%乙醇，于50℃水浴中浸泡24 h，然后室溫下超聲30 min，過濾，所得濾渣重復上述操作，合并2次濾液。將濾液于50℃水浴中減壓濃縮至干重得提取物，稱重后用75%乙醇定容為200 mg/mL的生藥提取液，于4℃保存。

1.4.2菌株培養(yǎng)與總蛋白提取 先將凍存的白念珠菌SC5314菌液接種至YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h進行活化，再將活化的白念珠菌SC5314單克隆接種在1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，并加入五倍子提取液使其終濃度為4 μg/mL(對照組加入等體積的75%乙醇)，于30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約16 h。將菌液于室溫5 000 r/min離心3min，收集菌體并用滅菌PBS溶液洗滌3次，然后分別收集五倍子組和對照組的菌體各40 mg，置于冰浴中，利用生物樣品均質器徹底研磨，于4℃、13 000 r/min高速離心10 min，取上清液即為白念珠菌總蛋白溶液，BCA法測定蛋白質濃度，于-80℃保存。

1.4.3SDS-PAGE電泳 取五倍子組和對照組的白念珠菌總蛋白溶液20 μL置于冰板上，加入4 μL 5×上樣緩沖液，95℃水浴10 min使蛋白質變性。隨后進行SDS-PAGE電泳(80 V、30 min；120 V、1 h)，考馬斯亮藍染色。

1.4.4蛋白質酶解和iTRAQ試劑標記 分別取含100 μg白念珠菌總蛋白的五倍子組和對照組蛋白溶液各2份，按照iTRAQ試劑盒說明書操作，每份加入4 μL TCEP溶液，60℃孵育1 h，然后加入2 μL MMTS溶液，室溫避光孵育20 min。隨后將蛋白溶液轉移至超濾管，13 000 r/min離心20 min，向超濾管中加入100 μL洗脫緩沖液洗滌，重復洗滌3次。然后加入50 μL胰蛋白酶，37℃孵育過夜。次日13 000 r/min離心20 min后向超濾管中加入50 μL洗脫緩沖液，再次離心20 min，所得即為肽段溶液。分別用113號、114號標簽標記五倍子組蛋白酶解產物，用115號、116號標簽標記對照組蛋白酶解產物，室溫反應2 h，將標記好的肽段混合在一起，真空冷凍離心干燥備用。

1.4.5液相分級——高pH反相分級 將干燥的混合樣品用100 μL流動相A(20 mmol/L甲酸胺，pH 10)復溶，然后對樣品進行梯度洗脫。色譜柱為：流動相A：20 mmol/L甲酸銨，pH 10；流動相B：20% 20 mmol/L甲酸胺，80% 乙腈，pH 10。梯度條件為：0～5 min，5% B；5～30 min，5%升至15% B；30～45 min，15%升至38% B；45～46 min，38%升至90% B；46～54.5 min，90% B；54.5～55 min，90%降至5% B；55～65 min，5% B；流速為0.8 mL/min。從第5分鐘開始，收集每分鐘的流分(真空冷凍離心干燥)，采集相應的色譜圖，并依據(jù)各流分色譜圖復雜程度進行組合，再用50 μL 2%乙腈、0.1%甲酸復溶各組分，混合后合并為10個組分。

1.4.6Nano LC-ESI-MS/MS分析 使用AB SCIEX TripleTOFTM5600質譜儀和Eksigentnano LC-UltraTMsystem進行分析。Trap柱：ChromXP C18(350 μm×0.5 mm，3 μm，120A)，流速3 μL/min，上樣時間15 min；分析柱：C18反相色譜柱(0.075×150 mm，3 μm，120A)。流動相A：0.1%甲酸；流動相B：98% 乙腈、2%超純水、0.1%甲酸，流速為300 nL/min。洗脫梯度：0～0.1 min，5%升至10% B；0.1～60 min，10%升至28% B；60～75 min，28%升至50% B；75～75.5 min，50%升至80% B；75.5～80 min，80% B；80～80.5 min，80%降至5% B；80.5～90 min，5% B。主要參數(shù)：ESI正離子模式，MS1采集范圍350～1250 m/z，掃描時間0.25 s。選擇性的采集m/z范圍內強度>40且?guī)щ姾蓴?shù)+2～+5母粒子進行打碎，二級質譜采集范圍100～1 500 m/z。按上述LC-MS條件分別對10個組分進行數(shù)據(jù)采集，每個組分重復走2針。

1.4.7蛋白質定性及定量分析 使用ProteinPilot 4.5軟件(AB SCIEX)進行蛋白質的定性鑒別及定量分析，該軟件主要使用Paragon算法(4.5.0.0.1654)作為搜索引擎。將蛋白質數(shù)據(jù)庫導入軟件中，使用ProGroup算法對蛋白質進行定性鑒別，使用Paragon算法對蛋白質進行定量分析。搜索的參數(shù)設置為：MS/MS容忍度為0.1 Da；Sample Type：iTRAQ 8plex；Cys. Alkylation：MMTS；Digestion：Trypsin；Instrument：TripleTOFTM5600 system；I Special Factors：None； Species：Mus；ID Focus：Biological modifica-tions；Search Effort：Thorough；FDR Analysis：Yes；User Modified Parameter Files：No。在錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<1%的基礎上，將鑒別到至少含有2條唯一的肽段，且置信度>99%的蛋白質視為可信蛋白。

1.4.8差異蛋白及生物信息學分析 在獲取iTRAQ實驗蛋白定性及定量數(shù)據(jù)后，進行差異蛋白分析。差異蛋白選取標準為：①unused值>2；②統(tǒng)計檢驗P<0.05；③蛋白豐度差異倍數(shù)>1.3或<0.77。獲取4個標記的全部差異表達蛋白后，對五倍子醇提取物處理前后白念珠菌SC5314的差異蛋白進行統(tǒng)計，得到差異蛋白譜。使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)生物信息學分析工具對所得差異蛋白進行基于GO(gene ontology)的細胞組件、分子功能和生物過程富集分析，同時，對差異蛋白進行KEGG生物學通路富集分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

本研究實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P<0. 05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 白念珠菌總蛋白的提取及質控

為了提高實驗的準確性，首先要高質量的提取蛋白質。本研究分別定量提取了五倍子組和對照組40 mg白念珠菌菌體的總蛋白，并以蛋白濃度穩(wěn)定、SDS-PAGE電泳蛋白條帶清晰且均勻為質控標準，確保用于iTRAQ實驗的蛋白質符合要求。BCA法測得五倍子處理組總蛋白濃度為10.46 mg/mL，對照組總蛋白濃度為10.23 mg/mL。SDS-PAGE電泳如圖1所示，2組蛋白條帶清晰、均勻，無明顯差異。表明2組樣品蛋白提取差異較小，定量一致。

2.2 總蛋白的質譜定量分析和鑒定

本研究采用ProteinPilot 4.5軟件和白念珠菌蛋白數(shù)據(jù)庫進行蛋白質的定性鑒別及定量分析，2組樣品iTRAQ實驗共檢出3 721種蛋白質。根據(jù)蛋白豐度差異倍數(shù)>1.3或<0.77、特異性肽段≥2、P<0.05的標準，鑒定得到差異表達蛋白104種，其中表達上調蛋白57種，表達下調蛋白47種，差異蛋白詳細信息見表1。

圖1 白念珠菌總蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of total protein extracted from Candida albicans.M：蛋白分子量標準；1：對照組；2：五倍子處理組。

2.3 差異蛋白的GO富集分析

GO(gene ontology)是一個國際標準化的基因本體功能分類體系工具，用來全面描述生物體中基因和蛋白質的屬性。GO共有3個大類，分別描述構成的細胞組件(cell component，CC)、基因或蛋白質的分子功能(molecular function，MF)以及參與的生物過程(biological processes，BP)[6]。

從GO富集分析結果中篩選出具有顯著性富集的條目，結果如圖2所示。104種差異蛋白所在的細胞組件主要位于菌絲細胞壁(10種)、細胞表面(12種)、酵母態(tài)細胞壁(8種)、質膜(15種)和細胞質(17種)等。差異蛋白參與的分子功能主 要與結合功能有關，包括吡哆醛磷酸結合(8種)、金屬離子結合(16種)、4鐵4硫團簇結合(5種)、血紅素結合(6種)和NAD結合(5種)等。參與的生物學過程主要包括三羧酸循環(huán)(6種)、過氧化氫分解代謝(5種)、蛋氨酸生物合成(4種)、磷酸戊糖途徑(4種)、糖異生(6種)和細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)(5種)等。

表1 五倍子組與對照組差異表達蛋白Table 1 Differentially expressed proteins between Galla Chinensis treatment group and control group.

圖2 五倍子組與對照組差異蛋白GO富集分析Fig.2 Gene ontology analysis of differentially expressed proteins between Galla Chinensis group and control group.A：細胞組件；B：分子功能；C：生物過程

在細胞組件這一大類中，絕大多數(shù)差異蛋白參與到不同形態(tài)(酵母態(tài)和菌絲態(tài))菌細胞的表面或膜構成組件中，可見，菌體在五倍子作用下，其細胞表面或膜成分可能受到影響或被破壞，如MET6、PET9、ATP5和NUC2等蛋白質為細胞表面毒力因子或膜組成部分，其表達量顯著下降，會影響細胞表面或膜結構，以及菌與環(huán)境或宿主的相互作用。在分子功能中，差異蛋白主要集中于對各種離子或分子的結合能力，如對金屬離子、鐵硫簇、NAD及血紅素等的結合，其次是酶活性能力，如氧化還原酶活性。富集于各種結合能力的33種蛋白質中，有19種的表達均顯著下降；富集于NAD(P)H的氧化還原酶活性的差異蛋白也是顯著下調的。這說明在五倍子作用下，菌體內的氧化還原酶以及分子或離子結合蛋白的活性發(fā)生了顯著變化。在生物過程中，代謝過程、氧化反應和能量生成中有較多差異蛋白富集，顯示五倍子確實改變了菌細胞代謝和能量產生過程。此外，以MET6為代表的部分差異蛋白參與白念珠菌與宿主的相互作用和宿主防御反應的共生誘導過程，這進一步說明五倍子已經影響到了白念珠菌與宿主的關系。

2.4 差異蛋白的生物學通路富集分析

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genome)是一個用于查詢代謝通路、酶促通路、酶或編碼酶的基因以及生物化學物質的在線數(shù)據(jù)庫，其整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能等信息[7]。KEGG通路數(shù)據(jù)庫包含了相應生物通路中分子相互作用網絡以及具體某個生物所特有的變化形式，從而確定蛋白質參與的最主要的信號轉導通路和生化代謝通路。在生物體內，不同蛋白質相互協(xié)調、相互調控表現(xiàn)為生物學行為，基于通路的分析更有助于了解基因或蛋白質的生物學功能[8]。

將五倍子作用白念珠菌后差異表達的104種蛋白質進行KEGG通路分析，結果表明，這些蛋白質富集于18條KEGG通路，主要包括代謝途徑、生物合成抗生素、次生代謝物的生物合成、碳代謝和氨基酸的生物合成等。如圖3所示，在這些差異蛋白富集的通路中，最集中的是不同物質的代謝通路，如碳、丙酮酸、硒代化合物及各種氨基酸等，其次為一些物質的合成路徑，如次生代謝物、抗生素和糖等。值得注意的是，富集于氧化磷酸化途徑的14個差異蛋白的表達量均顯著下調。其中9個蛋白質呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，由此可知菌體的氧化磷酸化途徑由于五倍子的作用而受到明顯抑制，而其他一系列生物過程，如能量代謝、物質生成及各種離子或分子結合過程等也發(fā)生顯著變化，進而造成菌細胞結構和功能的變化。

圖3 五倍子組與對照組差異蛋白KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of differentially expressed proteins between Galla Chinensis group and control group.

3 討論

近年來，深部真菌感染的發(fā)病率和死亡率日益增加，臨床上常用的抗真菌藥物面臨著種類少、耐藥性強、副作用多的窘境[9, 10]。中藥是中華民族的瑰寶，具有歷史悠久、毒副作用小、不易產生耐藥性等優(yōu)點，挖掘中藥寶庫一直是相關領域的研究熱點。

本研究采用了基于iTRAQ的定量蛋白質組學技術，研究中藥五倍子醇提物處理白念珠菌后差異蛋白質組學的變化。在體外培養(yǎng)條件下，共鑒定到104種差異表達蛋白。其中，上調比例最顯著的為CIP1蛋白，五倍子處理后其表達量為對照組的12.72倍。CIP1是可能的氧化還原酶，有研究表明其在白念珠菌建立對鎘處理產生的應激反應中起關鍵作用[11]，且CIP1還可通過抗性途徑參與白念珠菌氧化應激反應[12]。

此外，通過對差異蛋白的GO富集分析發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質參與到生物過程中的氧化還原反應、過氧化氫分解代謝及能量代謝過程，在分子功能中也參與氧化還原活性。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)的18條相關通路主要集中在代謝通路和氧化還原通路，且氧化磷酸化途徑相關蛋白表達均下調。

近幾年關于五倍子研究的文獻報道，主要集中于其防齲、消炎、抗菌和抗病毒等方面的作用[2,13～15]。付雪艷等[16]在考察不同產地(云南、浙江、陜西、河北、湖南)的五倍子的體外抗菌作用時，發(fā)現(xiàn)不同產地的五倍子，其作用也不同，如云南產五倍子醇提物對一些病原細菌(如大腸桿菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌等)的抑菌作用最強，而浙江、陜西產的五倍子醇提物則對白念球菌的抑菌作用強。代敏等[15]則進一步探討研究了五倍子醇提物不同有效部位的體外抗細菌、真菌的活性，并發(fā)現(xiàn)五倍子的乙酸乙酯部位具有較強的抗細菌、真菌的活性。最新研究表明，五倍子還具有潛在的抗腫瘤作用[17]。

國內對于五倍子的研究主要局限于其各種提取物(如水、醇和乙酸乙酯等)的抗病原微生物活性作用，而其具體分子機制的研究鮮有報道。本研究首次采用組學方法(iTRAQ蛋白質組學技術)結合質譜技術(LC-MS/MS)鑒定了五倍子提取液作用下白念珠菌的差異表達蛋白，并利用生物信息學方法對差異蛋白的定位、分子功能及參與的生物學過程進行了系統(tǒng)分析，以期從分子水平闡述五倍子發(fā)揮抗白念珠菌活性的作用機理。本研究結果顯示，五倍子可能通過抑制白念珠菌的氧化磷酸化，影響菌的能量代謝和物質生成，從而造成細胞結構與功能改變，起到發(fā)揮抗白念珠菌作用，但其具體分子靶點和作用機制仍需進一步深入探索和驗證。