王金鵬 ， 王 萍 ， 苑 征 ， 李林林 ， 范浩然 ， 金征宇

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD）是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 （cyclodextrin glycosyltransferase，簡(jiǎn)稱CGTase）酶解淀粉或者淀粉類似物產(chǎn)生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚化合物[1-3]。與α-CD、β-CD相比，γ-CD具有獨(dú)特的性質(zhì)：首先，γ-CD具有較大的空腔和較高的溶解度，能夠包埋較大的客體分子從而增加其溶解度，進(jìn)而改變它們的理化性質(zhì)；其次，γ-CD安全性高，可以被人體內(nèi)的唾液淀粉酶和胰異淀粉酶迅速消化[4-5]，因此，γ-CD在人體小腸內(nèi)可以迅速的降解和吸收[6-7]，但α-CD、β-CD則不能。并且γ-CD的高生物利用度使得其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著特殊的應(yīng)用。

影響γ-CD產(chǎn)率及產(chǎn)物專一性的因素有很多，主要包括CGTase的來源及其酶學(xué)特性，反應(yīng)條件如反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度、底物種類、有機(jī)溶劑種類及含量等的影響。曹新志等[8]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的馬鈴薯、玉米、木薯、甘薯、焦藕淀粉為底物，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的甘草酸和適量的CGTase酶液，于60℃反應(yīng)12 h，結(jié)果表明以木薯淀粉和焦藕淀粉為底物時(shí)γ-CD轉(zhuǎn)化率最高；Rendleman等人[9]利用Bacillus sp.AL6生產(chǎn)γ-CD時(shí)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)由2.5%增加到6%時(shí)，γ-CD的轉(zhuǎn)化率卻由35%降到了21%。Kyoko等人[10]研究發(fā)現(xiàn)改變反應(yīng)的pH，也會(huì)使環(huán)糊精種類所占比例發(fā)生改變。還有研究表明，在低溫及有機(jī)溶劑存在的條件下，更有利于提高環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率，因?yàn)榈蜏貤l件下環(huán)糊精-有機(jī)溶劑復(fù)合物更加穩(wěn)定，易于將環(huán)糊精從反應(yīng)體系中沉淀出來，使酶反應(yīng)向著正方向進(jìn)行[11-12]。

作者所用γ-CGTase來自于Bacillussp.G-825-6，據(jù)報(bào)道該酶催化淀粉不產(chǎn)生α-CD，僅產(chǎn)生β-CD和γ-CD。作者依據(jù)參考文獻(xiàn)，對(duì)該酶位于-7亞位點(diǎn)附近的211位氨基酸（酪氨酸）進(jìn)行了定點(diǎn)突變，研究了突變體Y211L催化淀粉產(chǎn)γ-CD的條件，對(duì)于降低γ-CD的生產(chǎn)成本和推動(dòng)γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒 pET-20b （+）/γ-cgt： 德國(guó)萊比錫大學(xué)Zimmermann教授提供；克隆宿主E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）：購(gòu)于南京百斯凱科技有限公司。

可溶性淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、氨芐、三羥甲基氨基甲烷等：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

高速冷凍離心機(jī)（BIOFUGE PRIMOR）：美國(guó)Thermo Scientific有限公司產(chǎn)品；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1900）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（LC-20AT230V）、示差折光檢測(cè)器 （RID-10A）、AKTA purifier900蛋白純化系統(tǒng)：島津公司產(chǎn)品；Hypersil NH2色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 mAPS-2Hypersil 微 粒 ）： 美 國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；純泰Ni-NTA親和層析柱：GE Healthcare life sciences公司產(chǎn)品；ShodexOHpak SB-804 HQ和OHpak SB-802.5 HQ色譜柱：日本昭和公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變體的構(gòu)建 以質(zhì)粒 pET-20b（+）/cgt為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)引物，采用一步PCR法突變CGTase基因中的相應(yīng)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物如下：

正向引物：5’-ATC GAAATCTTCTTGATTTAG CTAGT-3’，

反 向 引 物 ：5’ -GACTAGCTAAATCAAGAA GAT TTC GAT-3’，

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板10～100 ng，正向突變引物（10 μmol/L）1 μL，反向突變引物（10 μmol/L）1 μL，5×Reaction Buffer10 μL，F(xiàn)ast Alteration DNA Polymerase（2.5 U/μL）1.5 μL，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至 50 μL。

質(zhì)粒DNA的提取按照Thermo Scientific公司的質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取。

PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性（95℃）3 min；變性（95 ℃）30 s，退火（55 ℃）30 s，延伸（72 ℃）3 min，共30個(gè)循環(huán)；延伸（72℃）5 min，冷卻至 4℃。

取PCR產(chǎn)物50 μL加入20 U/μL的限制性內(nèi)切酶DpnI 1 μL，充分混勻后將該酶切體系于37℃條件下消化1 h。

將酶切后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌中，具體步驟如下：從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH-5α置于冰上解凍；取45 μL剛剛解凍好的感受態(tài)細(xì)胞和5 μL DpnI消化產(chǎn)物放于提前預(yù)冷好的2 mL無菌離心管中，用槍頭輕柔吹打混勻，繼續(xù)冰浴30 min；將試管放到42℃水浴鍋中，準(zhǔn)確熱激60 s，立即置于冰上5 min；加入500 μL預(yù)熱的無菌的LB培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后置于37℃搖床以200 r/min振蕩培養(yǎng)1.5 h，使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，5 000 r/min離心5 min，去掉上清液400 μL。將余下的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有Amp的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16 h。

挑取LB平板上的單菌落接種至含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中以200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，然后提取質(zhì)粒、酶切，DNA瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至上海生物工程公司測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3），挑取單菌落接種至含有 100 μg/mL氨芐青霉素鈉的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中以200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，保藏菌種即得到含有突變質(zhì)粒的基因工程菌，將該基因工程菌置于-80℃冰箱中保藏。

1.2.2 Y211L/γ-CGTase 的制備、純化

1）溶液配制方法 LB培養(yǎng)基配制：取胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g，加入去離子水1 L，攪拌均勻后分裝，于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌15 min；IPTG溶液制備：準(zhǔn)確稱取1.19 g異丙基-β-D-硫代半乳糖苷置于10 mL燒杯中，加入少量無菌水溶解后，轉(zhuǎn)移至滅菌的5 mL容量瓶中定容，分裝后于-18℃下保存；氨芐溶液配制：準(zhǔn)確稱取1 g氨芐置于10 mL燒杯中，加入少量無菌水溶解后，轉(zhuǎn)移至滅菌的10 mL容量瓶中定容，分裝后于-18℃下保存；Tris-HCl溶液配制：取6.05 g三羥甲基氨基甲烷置于1 L的燒杯中，加入1 L去離子水溶解，滴加鹽酸用pH計(jì)調(diào)pH至0.85，后置于4℃冰箱保存。

2）環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的制備方法 從冰箱中取出甘油管保藏菌接種至含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，在37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 h。

按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量接種至含有100 mL培養(yǎng)基的500 mL的錐形瓶中培養(yǎng)，在600 nm下測(cè)定吸光度，待A600nm=0.6～0.8時(shí)加入IPTG使其終濃度為0.05 mmol/L，后在18℃、200 r/min下誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)結(jié)束后，菌液在5 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體。將菌體懸浮于pH 8.5的Tris-HCl中進(jìn)行超聲破碎，離心后所得上清液即粗酶液。

3）環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的純化方法 粗酶液純化采用淀粉吸附法。向粗酶液中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%加入玉米淀粉，然后加入硫酸銨使其終濃度為1 mol/L，在4℃下緩慢攪拌1 h，使酶充分被淀粉吸附；反應(yīng)結(jié)束后將混合物5 000 r/min離心15 min，沉淀用預(yù)冷的1 mol/L的硫酸銨洗滌除去未被吸附的蛋白質(zhì)，離心后取沉淀；將沉淀用含有1 mmol/L γ-CD的50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl在37℃下振蕩混合30 min離心后得到洗脫液1，將剩余沉淀再用同樣的含有γ-CD的緩沖液洗脫，得到洗脫液2；將兩次洗脫液合并，用50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖溶液在4℃透析24 h，每隔8 h換一次緩沖溶液。

1.2.3 γ-CD標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法 稱取0.4 g γ-CD，用少量超純水溶解后定容至100 mL，配制成4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL，取適量稀釋液過膜用高效液相色譜法測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定條件為流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)70%乙腈，流量1 mL/min，溫度40℃，進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 酶活測(cè)定 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的可溶性淀粉為底物，取900 μL底物于2 mL離心管中加入100 μL酶液，置于酶反應(yīng)器上反應(yīng)50℃，800 r/min反應(yīng)半小時(shí)后取500 μL沸水浴中滅活10 min，測(cè)定。剩余的500 μL繼續(xù)反應(yīng)半小時(shí)后煮沸滅活，測(cè)定。

測(cè)定方法：以γ-CD的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)采用高效液相色譜法進(jìn)行分析。取反應(yīng)液500 μL加入500 μL乙腈10 000 r/min離心10 min取上清液過膜，進(jìn)行測(cè)定分析，分析條件為流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)70%乙腈，流量 1 mL/min，溫度 40 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

酶活定義：上述方法，每30 min生成1 mmol的γ-CD需要的酶量為一個(gè)酶活單位。

1.2.5 催化條件優(yōu)化方法

1）單因素實(shí)驗(yàn) 以γ-CD的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)分別考察底物種類、底物濃度、加酶量、反應(yīng)時(shí)間對(duì)CGTase催化淀粉分解的影響。

分別取玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉做為底物，加入去離子水加熱糊化，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液，冷卻到室溫，取1 mL底物加入適量CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應(yīng)24 h，結(jié)束后沸水浴滅酶10 min。取500 μL反應(yīng)液加入500 μL乙腈10 000 r/min離心10 min后過膜，采用HPLC對(duì)γ-CD含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法與2.3.2中相同。

取最適底物，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%的溶液，加熱糊化后冷卻到室溫，取1 mL底物加入適量CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應(yīng)24 h，結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，取500 μL反應(yīng)液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min離心 10 min后過膜，采用HPLC對(duì)γ-CD含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法與2.3.3中相同。

選取最佳底物配制成最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，加熱糊化后冷卻到室溫，取1 mL底物分別加入2、4、6、8、10 U/g的CGTase，置于恒溫震蕩混勻器上反應(yīng)24 h，結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，取500 μL反應(yīng)液加入 500 μL乙腈 10 000 r/min離心 10 min后過膜，采用HPLC對(duì)γ-CD含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法與2.3.3中相同。

2）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，選用正交表L9（33）對(duì)CGTase的催化淀粉分解條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Minitab16軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變體的驗(yàn)證

用DNAman對(duì)目的基因堿基序列和突變后的堿基序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)目的基因中的酪氨酸Y（TAT）成功突變成了亮氨酸 L（CTT），結(jié)果見圖 1。

圖1 突變前后基因的堿基序列比對(duì)圖Fig.1 Base sequence alignment for the gene before and after mutation

2.2 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉條件探索

2.2.1 底物種類對(duì)催化反應(yīng)的影響 由圖2可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉的反應(yīng)中，不同的反應(yīng)底物對(duì)γ-CD的得率影響較大。其中木薯淀粉為底物時(shí)γ-CD的得率最高，馬鈴薯淀粉和可溶性淀粉為底物時(shí)γ-CD的得率較小。推測(cè)其原因是，不同來源的淀粉其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比例不同，且分子量大小存在很大差異，這將影響γ-CGTase（Y211L）催化作用，進(jìn)而造成不同的環(huán)糊精產(chǎn)率。

2.2.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)催化反應(yīng)的影響 由圖3可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉產(chǎn)生γ-CD的質(zhì)量濃度先增加后減少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)γ-CD的質(zhì)量濃度達(dá)到最大，推測(cè)原因可能是由于低濃度時(shí)，酶催化反應(yīng)較徹底，體系中小分子濃度較高，加劇了CGTase的偶合和環(huán)化作用，造成了較低的環(huán)糊精含量，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，反應(yīng)向環(huán)化方向偏移，但底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，造成兩個(gè)或兩個(gè)以上的底物分子占據(jù)酶蛋白的活性位點(diǎn)，這可能會(huì)形成無活性的中間產(chǎn)物，使酶活性受到抑制。而且，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，體系黏度較大，底物流動(dòng)性減小，使酶無法與底物充分接觸，減弱 γ-CGTase（Y211L）的環(huán)化作用。

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on catalysis

2.2.3 加酶量對(duì)催化反應(yīng)的影響 如圖4可知，CGTase催化淀粉反應(yīng)隨加酶量的增加γ-CD的產(chǎn)量先增加后減少，在4 U/g時(shí)γ-CD的產(chǎn)量最大，因此加酶量選取4 U/g。

γ-CD產(chǎn)量隨加酶量先增加后減少，可能是由于加酶量過少時(shí)，反應(yīng)緩慢；加酶量過高時(shí)，酶催化反應(yīng)較徹底，環(huán)糊精降解，體系中小分子濃度較高。

圖4 加酶量對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on catalysis

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化反應(yīng)的影響 如圖5可知，γ-CGTase（Y211L）催化淀粉反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間的增加γ-CD的產(chǎn)量不斷增加，在24 h之前增加較快，24 h之后增加緩慢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于，在反應(yīng)開始階段，體系中長(zhǎng)鏈底物較多，利于環(huán)化反應(yīng)進(jìn)行，因此γ-CD的產(chǎn)量增加較快。但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中產(chǎn)物不斷增加，競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物抑制作用加強(qiáng)，環(huán)化反應(yīng)活性降低；同時(shí)，可能由于小分子濃度的增加，促進(jìn)了CGTase的偶合和歧化作用，因而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of time on catalysis

2.3 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉條件優(yōu)化

以單因素探索的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、反應(yīng)時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)γ-CD產(chǎn)率的影響為依據(jù)，進(jìn)行3因素、3水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

由表2可知，CGTase催化淀粉分解的最佳參數(shù)為A3B1C1，因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)锳＞B＞C，所以CGTase催化淀粉分解的最佳條件為：反應(yīng)底物木薯淀粉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，加酶量4 U/g，反應(yīng)時(shí)間24 h，反應(yīng)溫度50℃。

表2 正交結(jié)果和分析Table 2 Results and analysis of orthogonal

2.4 γ-CGTase（Y211L）催化淀粉產(chǎn)物的分析

在同樣的催化條件下，原始的γ-CGTase催化淀粉后產(chǎn)物的HPAEC測(cè)定圖如圖6（a）所示，突變體Y211L的催化產(chǎn)物圖如圖6（b）所示，由圖可以看出，突變體Y211L催化生成的環(huán)糊精中γ-CD明顯提高，表明突變體具有良好的催化專一性，該研究能為γ-CD的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

3 結(jié) 語

γ-CGTase（Y211L）是一種多功能酶，它能夠通過環(huán)化反應(yīng)催化淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精。目前對(duì)于CGTase催化淀粉產(chǎn)物的研究主要集中于產(chǎn)α-CD、β-CD，對(duì)γ-CD的研究較少。但是γ-CD具有較高的溶解性，同時(shí)其空腔也較大，具有較好的應(yīng)用前景。作者構(gòu)建了γ-CGTase突變體Y211L，從單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了制備γ-CD的條件優(yōu)化，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下提高了γ-CD的產(chǎn)量，對(duì)以后γ-CD產(chǎn)量的提高及其應(yīng)用具有一定參考價(jià)值。