田鋒亮，李延萍，楊小軍，劉 宇，陳萬(wàn)群

(1.重慶市中醫(yī)院消化科 400021；2.重慶市中醫(yī)院 400021)

胃黏膜腸上皮化生(gastric intestinal metaplasia，GIM)是指胃黏膜中出現(xiàn)類似小腸或大腸黏膜的上皮細(xì)胞，由胃固有腺體頸部未分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，GIM的診斷需要病理明確：光鏡下出現(xiàn)胃黏膜組織腸上皮的杯狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和PAS陽(yáng)性的具有刷狀緣的細(xì)胞。它是一種癌前病變，可增加胃癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，胃癌經(jīng)歷了慢性胃炎-萎縮性胃炎(atrophic gastritis,AG)-腸上皮化生(IM)-異型增生-胃癌多步驟復(fù)雜的發(fā)展過(guò)程[1]。有研究認(rèn)為化生在某種條件下是可逆轉(zhuǎn)或被清除的[2]，對(duì)GIM的治療成為胃癌早期干預(yù)的突破點(diǎn)，目前尚無(wú)有效的西藥治療慢性AG(CAG)及GIM，某些中藥及相關(guān)制劑對(duì)AG伴IM的研究報(bào)道較多，本課題組前期研究結(jié)果顯示，益胃消瘀顆粒(Yiwei Xiaoyu particulate matter，YWXY)治療AG及癌前病變有效[3]，本實(shí)驗(yàn)采用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)造模的AG伴IM大鼠，給予YWXY治療，觀察大鼠胃組織的病理改變，檢測(cè)其對(duì)胃蛋白酶原(PG)Ⅰ/Ⅱ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胃黏膜NF-κB、Bcl-2、Fas、Bax、Smad4、骨形成蛋白4(BMP4)等相關(guān)腫瘤因子的影響，探討YWXY治療GIM及抑制癌變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，8周齡，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK-PLA-20120031，并經(jīng)試驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)。

1.1.2藥物及配制 YWXY有紅參、三七、白術(shù)、薏苡仁、法落海、娑羅子、浙貝母等組成，由本院制劑室制作。MNNG試劑購(gòu)于TCL公司。MNNG用去離子水配成1 g/L的儲(chǔ)備液(每周配制1次)，4 ℃冰箱避光保存，用前以自來(lái)水稀釋為50 mg/L的溶液，裝入避光飲水瓶?jī)?nèi)給大鼠自由飲用。法莫替丁購(gòu)于阿拉丁公司，配制成含0.004%法莫替丁的粉末狀飼料，胃復(fù)春購(gòu)于杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司。

1.1.3主要試劑與儀器 所有ELISA試劑盒購(gòu)自廈門慧嘉公司，NF-κB及β-actin 引物購(gòu)自上海百力格生物工程公司?？贵wNKX6.3(DF6461)和BMP4(AF0302)購(gòu)自Affinity公司。CFX96定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；WB成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)SYNGENE公司；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模與分組 將60只雄性大鼠，分成對(duì)照組、模型組及YWXY高、中、低劑量組和胃復(fù)春組，每組10只，對(duì)照組常規(guī)喂養(yǎng)，其余50只采用MNNG誘導(dǎo)造模。MNNG每24小時(shí)更換1次藥液，造模期間不再給予其他飲水。造模6個(gè)月抽檢3只大鼠病理提示僅存在胃黏膜萎縮，未見(jiàn)IM，7個(gè)月再次抽檢3只大鼠病理均提示胃黏膜萎縮伴IM，剩余存活大鼠即為有效動(dòng)物。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002)[4]中GAG的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理確診：(1)固有腺體萎縮；(2)黏膜肌層增厚；(3)可有IM或假幽門腺上皮化生；(4)固有膜炎癥；(5)可有淋巴濾泡形成。

1.2.2用藥 造模成功后，對(duì)照組、模型組繼續(xù)正常喂養(yǎng)，不給任何藥物；YWXY低、中、高劑量組，分別給予YWXY 0.75、1.50、2.25 g·kg-1·d-1給藥,每日分2次喂；胃復(fù)春組，按0.45 g·kg-1·d-1給藥，喂養(yǎng)3個(gè)月后將動(dòng)物處死。

1.2.3ELISA法檢查大鼠血清及胃組織PG Ⅰ/Ⅱ、TNF-α的水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部大鼠禁食24 h，用10%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血約10 mL，分離血清，-20 ℃低溫保存，檢測(cè)血清PG Ⅰ/Ⅱ、TNF-α水平。摘離全胃，沿大彎側(cè)剪開(kāi)，冷生理鹽水漂洗內(nèi)容物，再沿小彎側(cè)剪開(kāi)，一半用濾紙吸干水分，鈍刀片從胃竇側(cè)刮取胃黏膜50～100 mg，放入適量磷酸緩沖液中，電動(dòng)勻漿器制成10%勻漿(低溫)，離心(3 000 r/min)10 min，分離上清液，-20 ℃保存，檢測(cè)組織中PG Ⅰ/Ⅱ、TNF-α水平；一半置10%中性福爾馬林液中固定24 h后沿大小彎方向剪成約2 mm的條狀物，順序石蠟包埋，取一部分5 mm切片，行HE染色，觀察病理組織學(xué)改變。胃黏膜及血清PG Ⅰ/Ⅱ、TNF-α測(cè)定按試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)胃黏膜標(biāo)本中NF-κB、Bcl-2、Fas及Bax的表達(dá) 提取大鼠胃組織總RNA，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，NF-κB引物上游：5′-TTC AAC ATG GCA GAC GAC GA-3′，下游：5′-AGG TAT GGG CCA TCT GTT GAC-3′；Bcl-2引物上游：5′-CTG GTG GAC AAC ATC GCT CT-3′，下游 ：5′-GCA TGC TGG GGC CAT ATA GT-3′；Fas引物上游：5′-TGT CAG CCT GGT GAA CGA AA-3′，下游 ：5′-AGG CGC ACC TTC TGC ATT TA-3′；Bax引物上游：5′-GCG AAT TGG CGA TGA ACT GG-3′，下游：5′-CCC AGT TGA AGT TGC CGT CT-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，熔解曲線:60～95 ℃，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將原始數(shù)據(jù)、擴(kuò)增曲線和熔解曲線等信息從定量軟件中導(dǎo)出進(jìn)行分析，得出各個(gè)樣本目的基因的ct值，用相對(duì)定量2-△△Ct法分析結(jié)果。

1.2.5Western blot檢測(cè)Smad4、BMP4蛋白表達(dá) 從胃組織中抽提蛋白質(zhì)，BAC法測(cè)定總蛋白水平。取50 μg總蛋白與上樣液混合，上樣前100 ℃煮沸5 min。將蛋白加人點(diǎn)樣孔，電泳初始電壓80 V，溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料到達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。恒流30 mA，電轉(zhuǎn)120 min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出PVDF膜并標(biāo)記膜的方向。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，室溫振蕩60 min。TBST漂洗液洗膜8 min，共3次，將膜移入雜交器皿中，加入用一抗稀釋液按1∶1 000進(jìn)行稀釋的抗體(Smad4和BMP4)，封口后4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST漂洗液搖蕩洗膜10 min，共3次，將PVDF膜移入另一新的雜交器皿中，加入二抗稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，37 ℃振蕩60 min。加入ECL顯色液進(jìn)行顯色并拍照，用IPP軟件分析目的條帶灰度值，經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胃黏膜病理組織學(xué)結(jié)果 對(duì)照組大鼠胃黏膜上皮完整，固有層見(jiàn)密集排列的腺體，腺體大小、形態(tài)規(guī)則，散在少量淋巴細(xì)胞，未見(jiàn)胃黏膜萎縮。模型組大鼠胃黏膜顯示慢性炎癥，黏膜腺體減少，排列紊亂，可見(jiàn)囊性擴(kuò)張的腺體，腺上皮可見(jiàn)不同程度的IM，固有層淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，黏膜肌層增厚。YWXY高劑量組大鼠可見(jiàn)胃黏膜萎縮程度減輕，腺體增多，排列規(guī)則，散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。YWXY中劑量組大鼠胃黏膜萎縮程度減輕，腺體排列規(guī)則，IM明顯減少，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞散在浸潤(rùn)，小血管擴(kuò)張充血纖維組織增生。YWXY低劑量組大鼠胃黏膜仍見(jiàn)萎縮，但較模型組稍減輕，黏膜腺體稍增加，囊性擴(kuò)張腺體減少，排列稍規(guī)則，IM減少，可見(jiàn)固有層淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，小血管擴(kuò)張充血。胃復(fù)春組大鼠胃黏膜萎縮程度減輕，黏膜腺體增多，排列稍規(guī)則，有散在的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.2各組大鼠血清及胃黏膜組織PGⅠ、PGⅡ及TNF-α水平比較 與模型組比較，對(duì)照組和YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組血清PGⅠ水平明顯升高(P<0.01)；對(duì)照組及YWXY高、中劑量組胃黏膜PGⅠ水平明顯升高(P<0.01)。血清PGⅡ模型組下降，與對(duì)照組、YWXY低劑量組及胃富春組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組血清及胃黏膜TNF-α水平明顯升高，與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠胃黏膜組織NF-κB、Bcl-2、Fas及Bax表達(dá)水平比較 模型組胃黏膜NF-κB、Bcl-2表達(dá)明顯升高，與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組Fas表達(dá)下降，與對(duì)照組、YWXY高劑量組及胃復(fù)春組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組Bax表達(dá)明顯低于其他各組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

A:對(duì)照組；B：模型組；C：YWXY高劑量組；D：YWXY中劑量組；E：YWXY低劑量組；F：胃復(fù)春組

表1 各組大鼠血清和胃黏膜PGⅠ、PGⅡ及TNF-α水平比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與模型組比較

表2 各組大鼠胃黏膜組織NF-κB、Bcl-2、Fas及Bax表達(dá)水平比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與模型組比較

1:對(duì)照組；2：模型組；3：YWXY高劑量組；4：YWXY中劑量組;5：YWXY低劑量組；6：胃復(fù)春組；a:P<0.05，與模型組比較

2.4各組大鼠胃黏膜組織Smad4、BMP4表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組Smad4明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，YWXY高劑量組Smad4明顯升高(P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組BMP4明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組明顯下降(P<0.05),見(jiàn)圖2。

3 討 論

西醫(yī)認(rèn)為AG伴IM是胃癌前病變，隨著病情進(jìn)展，會(huì)導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，而GIM通過(guò)有效的治療，部分患者病情能夠得到控制和逆轉(zhuǎn)，在中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有“CAG伴IM”這一病名，根據(jù)本病常見(jiàn)的胃脘痞滿、胃中嘈雜、痞或不痛、納食減少等相關(guān)臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“胃痞”“胃脘痛”等范疇之中，中醫(yī)認(rèn)為本病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)之證，以脾陽(yáng)氣虛、胃陰虛為本，以氣郁、濕熱、痰濁、瘀血為標(biāo)，本病病位在脾胃，與肝的關(guān)系密切，辨證采用理氣、化濕、清熱、活血、補(bǔ)虛、通陽(yáng)等法治療[5-7]。根據(jù)本病特點(diǎn)，本研究自擬YWXY治療AG伴IM，藥方由紅參、三七、白術(shù)、薏苡仁、法落海、娑羅子、浙貝母等組成，具有益氣溫陽(yáng)、行氣化濕、活血化瘀之效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YWXY能夠改善大鼠胃黏膜萎縮IM的程度，且效果優(yōu)于胃復(fù)春片。

PG是胃液中胃蛋白酶沒(méi)有消化活性的前體物質(zhì)，其中PGⅠ主要由胃腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌，PGⅡ主要由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細(xì)胞分泌。在淺表性胃炎-AG-胃癌的發(fā)展過(guò)程中，均伴隨著PG的變化，PG可以作為治療和預(yù)防干預(yù)過(guò)程中重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究提示模型組大鼠血清、胃黏膜PGⅠ及PGⅡ與對(duì)照組比較均下降(P<0.05),YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組均能提高血清PGⅠ水平(P<0.01)，而YWXY高、中劑量組能夠提高胃組織PGⅠ水平(P<0.01)，YWXY低劑量組及胃富春組提高血清PGⅡ水平(P<0.05)，胃組織PGⅡ水平各組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果說(shuō)明AG伴IM大鼠血清及胃黏膜的PG1 水平下降，YWXY可以通過(guò)提高PGⅠ水平修復(fù)受損胃黏膜，是其治療AG伴IM的可能作用機(jī)制。

NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合的蛋白因子，NF-κB 可通過(guò)提高凋亡抑制蛋白的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞凋亡被延緩或抑制，從而加速癌癥的發(fā)展，NF-κB的激活，可誘導(dǎo)炎性遞質(zhì)和免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，如TNF-α，而TNF-α進(jìn) 一步 活 化NF-κB， 目前認(rèn)為TNF-α促腫瘤作用的機(jī)制是多途徑的，可能與其過(guò)度表達(dá)并與受體結(jié)合通過(guò)多條信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖，TNF-α可以調(diào)節(jié)端粒酶活性，通過(guò)NF-κB中的p65導(dǎo)致人類端粒酶催化亞基(hTERT)從細(xì)胞質(zhì)易位到核，最終推動(dòng)細(xì)胞無(wú)限增殖[8]；通過(guò)NF-κB途徑誘導(dǎo)激活的胞苷脫氨酶大量產(chǎn)生，引起腫瘤相關(guān)基因如p53和c-myc基因突變[9]。本研究提示，模型組大鼠胃黏膜NF-κB表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，YWXY高、中、低劑量均能夠抑制NF-κB的表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組血清及胃黏膜TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組血清及胃黏膜TNF-α水平均明顯下降(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明AG伴IM大鼠NF-κB、TNF-α表達(dá)升高， YWXY能夠抑制胃黏膜NF-κB的表達(dá)，降低大鼠血清及胃黏膜TNF-α水平，可能是其治療AG伴IM，預(yù)防癌變的作用機(jī)制之一。

Bcl-2是一種凋亡抑制基因，其激活后可轉(zhuǎn)錄生成親脂性膜蛋白，主要是通過(guò)抑制線粒體依賴性凋亡通路被激活的功能達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的作用。Bax基因則是凋亡促進(jìn)基因,與Bcl-2基因同屬一族,它不但可以拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用,而且還可直接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因子刺激后，Bcl-2/Bax的比率決定細(xì)胞的凋亡程度。Fas是細(xì)胞表面可以傳遞死亡信號(hào)的受體，其作為一種細(xì)胞膜抗原，主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抵抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用。胃癌癌前病變中，已經(jīng)存在細(xì)胞凋亡的異常和相關(guān)基因的改變，Bcl-2基因表達(dá)增高，F(xiàn)as、Bax基因表達(dá)減低，細(xì)胞凋亡受到抑制，這可能是胃癌癌前病變向胃癌發(fā)展的機(jī)制之一[10-12]。本研究顯示，模型組大鼠胃黏膜Bcl-2表達(dá) 明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組明顯低于模型組(P<0.05)；胃黏膜Fas模型組與對(duì)照組比較表達(dá)下降(P<0.01)，YWXY高劑量組與模型組比較表達(dá)升高(P<0.05)；胃黏膜Bax模型組與對(duì)照組比較表達(dá)下降(P<0.01)，YWXY高、中、低劑量組及胃復(fù)春組與模型組比較表達(dá)升高(P<0.01)。結(jié)果說(shuō)明AG伴IM大鼠Bcl-2表達(dá)升高，F(xiàn)as、Bax表達(dá)下降，YWXY能夠抑制胃黏膜Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Fas、Bax的表達(dá)，促進(jìn)了增殖細(xì)胞的凋亡，有效抑制細(xì)胞異常增殖，可能是其在預(yù)防胃黏膜萎縮IM繼續(xù)發(fā)展、癌變的作用機(jī)制。

Smad4基因位于人染色體18q21，其所編碼的Smad4蛋白是BMP通路的重要級(jí)聯(lián)分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[13]。胃癌組織中Smad4表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于正常胃組織，胃癌組織中Smad4的表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)[14]。BMP4屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員之一，在腫瘤形成過(guò)程中具有重要作用[15]，馬松林等[16]研究認(rèn)為BMP4能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲，其機(jī)制可能與上調(diào)Snail表達(dá)有關(guān)，BMP4通過(guò)它們經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)子Smad4在胃細(xì)胞系中上調(diào)Cdx2的表達(dá)[17]。本研究提示，模型組大鼠Smad4明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，YWXY高劑量組明顯高于模型組(P<0.01)；模型組BMP4明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，YWXY低、中、高劑量組明顯低于模型組(P<0.01)。說(shuō)明YWXY能夠促進(jìn)Smad4的表達(dá)，抑制BMP4的表達(dá)，是其抑制胃黏膜萎縮IM向癌變發(fā)展的可能機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)YWXY能夠改善大鼠胃黏膜萎縮IM的程度，提高PGⅠ水平，可能通過(guò)降低TNF-α水平，抑制胃黏膜NF-κB、Bcl-2、BMP4的表達(dá)，促進(jìn)Fas、Bax、Smad4的表達(dá)，抑制胃黏膜萎縮IM向癌變發(fā)展。