徐 核，譚艾娟，呂世明

(貴州大學(xué)：1.藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)系;2.生命科學(xué)學(xué)院;3動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機，可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅?！岸糁萍?xì)菌耐藥”已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大課題[1]。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機制有很多,其中，耐藥基因通過轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)在不同細(xì)菌間形成水平轉(zhuǎn)移最為重要[2]。因此，如果能抑制細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合，即能抑制細(xì)菌耐藥基因的轉(zhuǎn)移，就可能抑制耐藥菌或多重耐藥菌的形成，為解決目前面臨的嚴(yán)峻細(xì)菌耐藥問題尋找到一種新的有效途徑和方法[3]。為此本研究旨在以肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia,SP)標(biāo)準(zhǔn)菌株作為受體菌，以青霉素耐藥SP(penecillin resistant SP，PRSP)的DNA作為外源性DNA，以脫氧核糖核酸酶(deoxyribonucleases，DNase)作為抑制劑[4]，通過轉(zhuǎn)化和抑制轉(zhuǎn)化實驗，探討DNase在SP轉(zhuǎn)化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，以便為探究DNase抑制PRSP和其他相關(guān)耐藥菌的形成提供前期研究，為開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 (1)菌株來源：BNCC338425 SP標(biāo)準(zhǔn)菌株購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。臨床分離的PRSP最低抑菌濃度[(MIC)≥2 μg/mL]，由重慶醫(yī)科大學(xué)北碚附屬醫(yī)院惠贈。(2)主要儀器與試劑：微量移液器購自上海求精生化試劑儀器有限公司。超凈工作臺購自蘇州安泰空氣凈化有限公司。SZ-9Z自動三重純水蒸餾器購自上海亞榮生化儀器廠。LDZX-30FBS立式高壓滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠。SH2-82A恒溫振蕩器(搖床)購自常州澳華儀器有限公司。高速臺式離心機(TGL-161)購自上海安亭科學(xué)儀器廠。電熱恒溫水槽(DK-8D)購自上海一恒科技有限公司。NanoPhotometer超微量核酸測定儀購自德國的Implen公司。電熱恒溫箱購自上海賀德實驗設(shè)備有限公司。FA2004電子天平購自上海精科天平廠。腦心浸液肉湯(BHI培養(yǎng)基)購自貴州鼎國生物技術(shù)有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司。苯唑西林藥敏紙片購自貴陽宏碩生物科技有限公司。Optochin藥敏紙片購自上海金穂生物科技有限公司。DNase Ⅰ購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1提取PRSP的DNA并進(jìn)行相關(guān)鑒定 用微量移液器將PRSP保種液200 μL分別加入含1 mL BHI培養(yǎng)基的離心管中，置于37 ℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)13 h(大約為SP生長曲線平臺期的后期)，然后將每管少量的細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗，同時將每管內(nèi)的細(xì)菌培養(yǎng)液用煮沸法提取DNA以致每管獲得大約70 μL的DNA提取液,并檢測DNA溶液的濃度和純度。將DNA提取液儲存于-20 ℃冰箱內(nèi)以備用于轉(zhuǎn)化實驗和DNase抑制實驗。

1.2.2用外源性PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株并進(jìn)行相關(guān)鑒定 將消毒處理后的SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的凍干管移入超凈工作臺內(nèi)，將0.3 mL無菌水注入凍干管中并吹打以便使凍干菌粉充分溶解成菌懸液，將菌懸液接種至血平板上，置于37 ℃及5%CO2的電熱恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。待血平板上的菌懸液培養(yǎng)36 h并生長出典型成熟的SP菌落后，依次挑取SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的單菌落分別放入含1 mL BHI培養(yǎng)基的20個離心管中，然后將這些離心管隨機分成10個實驗組和10個對照組并置于37 ℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)時才能易于捕獲外源性DNA繼而發(fā)生轉(zhuǎn)化，而SP的感受態(tài)出現(xiàn)在對數(shù)生長期的后期，依據(jù)SP生長曲線在振蕩培養(yǎng)6 h后才開始進(jìn)入對數(shù)生長期后期，待振蕩培養(yǎng)6 h適時地向?qū)嶒灲M的每個離心管內(nèi)加入濃度為(87.3±47.3)μg/μL PRSP的DNA提取液140 μL，同時向?qū)φ战M的每個離心管內(nèi)加入濃度為0.9%的鹽水140 μL[5]。當(dāng)細(xì)菌群體的生長繁殖處于對數(shù)期和穩(wěn)定期交匯點時，液體培養(yǎng)基內(nèi)的被轉(zhuǎn)化和未被轉(zhuǎn)化的活細(xì)菌數(shù)已達(dá)到頂峰并且細(xì)菌轉(zhuǎn)化窗口已經(jīng)關(guān)閉(SP感受態(tài)持續(xù)約40 min)[5]，依據(jù)SP生長曲線這個交匯點大約為9 h，當(dāng)振蕩培養(yǎng)9 h實驗組和對照組同時結(jié)束培養(yǎng)[6]。然后取實驗組和對照組的每管少量細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗。

1.2.3DNase抑制PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株并進(jìn)行相關(guān)鑒定 SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的凍干菌粉復(fù)活培養(yǎng)與以上相關(guān)操作相同，實驗組和對照組的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基、培養(yǎng)的最初菌落數(shù)、培養(yǎng)的隨機分組及其他培養(yǎng)條件亦與以上相關(guān)內(nèi)容相同。當(dāng)實驗組和對照組在搖床內(nèi)培養(yǎng)6 h時，向?qū)嶒灲M的每個培養(yǎng)管中加入PRSP的DNA溶液140 μL和濃度為18.75 U/μL的DNase溶液100 μL〈溶劑為生理鹽水〉，以及分別向?qū)φ战M的每個培養(yǎng)管中加入PRSP的DNA溶液140 μL。當(dāng)振蕩培養(yǎng)9 h時實驗組和對照組結(jié)束培養(yǎng)。然后取實驗組和對照組的每管少量細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗。

2 結(jié) 果

2.1提取PRSP的DNA及相關(guān)鑒定結(jié)果 在PRSP保種液活化培養(yǎng)后，各培養(yǎng)管細(xì)菌的Optochin試驗均顯示陽性，即Optochin紙片的抑菌環(huán)直徑均大于14 mm；苯唑西林藥敏試驗顯示各培養(yǎng)管細(xì)菌對青霉素不敏感，即苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑均小于或等于19 mm；從各培養(yǎng)管的細(xì)菌懸液中均提取到DNA，即每管DNA提取液的體積約70 μL并且濃度為(87.3±47.3)μg/μL。

2.2PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株及相關(guān)鑒定結(jié)果 在轉(zhuǎn)化實驗后，實驗組和對照組細(xì)菌的Optochin紙片抑菌環(huán)直徑均大于14 mm，Optochin試驗均顯示陽性；在實驗組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外均有一個明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環(huán)帶，而在對照組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外無此特征性的抑菌環(huán)帶；實驗組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑為(23.3±2.2)mm，對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑為(33.5±3.0)mm，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.74，P<0.01)。原始結(jié)果見圖1。

2.3DNase抑制PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株及相關(guān)鑒定結(jié)果 在抑制轉(zhuǎn)化實驗后，實驗組和對照組細(xì)菌的Optochin紙片抑菌環(huán)直徑均大于14 mm，Optochin試驗均顯示陽性；在對照組的苯唑西林藥敏試驗中在每個抑菌圈外均有一個明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環(huán)帶，而在實驗組的苯唑西林藥敏試驗中抑菌圈外的抑菌環(huán)帶與對照組相比減弱；實驗組、對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑分別為(29.6±4.7)、(17.6±9.4)mm，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.60，P<0.05)。原始結(jié)果見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)化實驗后對照組和實驗組的Optochin試驗和青霉素藥敏試驗圖片

圖2 抑制轉(zhuǎn)化實驗后對照組和實驗組的Optochin試驗和青霉素藥敏試驗圖片

3 討 論

由于廣譜抗菌藥的濫用及細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移，細(xì)菌對常用抗菌藥物耐藥的發(fā)展已成為人類健康事業(yè)面臨的嚴(yán)重問題之一[7]。因此，合理應(yīng)用抗菌藥物是其主要的應(yīng)對措施，而開發(fā)的新型抗菌藥物不能隨時滿足臨床耐藥菌感染治療的需求[1]，阻斷細(xì)菌間耐藥基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)和藥物也很匱乏，以致使細(xì)菌耐藥危機日趨嚴(yán)峻[8]。鑒于細(xì)菌間耐藥基因的水平傳播是當(dāng)今細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因，探尋切斷細(xì)菌間耐藥基因水平傳播的新技術(shù)和新藥物將是破解細(xì)菌耐藥危機的重要途徑之一。為此，本研究以SP標(biāo)準(zhǔn)菌株作為受體菌，以PRSP的DNA作為外源性DNA，以DNase作為抑制劑，通過轉(zhuǎn)化和抑制轉(zhuǎn)化實驗，探討DNase在SP轉(zhuǎn)化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，為開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

本研究在提取DNA實驗階段，獲取了含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液。在對PRSP菌株(MIC≥2 μg/mL)培養(yǎng)后，培養(yǎng)后的細(xì)菌Optochin試驗顯示陽性和青霉素藥敏試驗顯示不敏感，說明PRSP菌株在培養(yǎng)過程中未被雜菌污染，培養(yǎng)后的細(xì)菌仍然是PRSP。用煮沸法從培養(yǎng)后的細(xì)菌懸液提取DNA后，DNA提取液的檢測結(jié)果顯示從各培養(yǎng)管的細(xì)菌懸液中均提取到DNA，表明每管均提取了PRSP的DNA。而據(jù)文獻(xiàn)報道，SP臨床菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性與pbp2b、pbp2x和pbp1a基因突變密切相關(guān)[9]，其中pbp2x基因突變可介導(dǎo)pbp2b、pbp1a等其他pbps基因突變，pbp2b基因突變導(dǎo)致低水平青霉素耐藥，pbp2b和pbp1a基因突變導(dǎo)致高水平青霉素耐藥[10]。結(jié)合以上研究，表明本研究從PRSP中提取的DNA應(yīng)該含有pbp2b、pbp2x和pbp1a突變基因，符合本研究轉(zhuǎn)化需要的含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA。

本研究在轉(zhuǎn)化實驗階段，用含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液，使SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感的菌株。依據(jù)轉(zhuǎn)化實驗后的Optochin試驗陽性結(jié)果，可判斷在轉(zhuǎn)化實驗過程中實驗組和對照組的SP均未受到雜菌污染；基于轉(zhuǎn)化實驗后的苯唑西林藥敏試驗結(jié)果：實驗組抑菌環(huán)直徑小于對照組(P<0.01)，可判斷實驗組的細(xì)菌獲得了青霉素低敏感的性狀；根據(jù)對照組的對等、同步和專設(shè)的作用[11-12]，判定實驗組細(xì)菌獲得的青霉素低敏感的性狀不是由非處理因素引起，而是由含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA引起[5]；根據(jù)文獻(xiàn)[12]報道可知，實驗組細(xì)菌獲得的青霉素低敏感的性狀是SP標(biāo)準(zhǔn)菌株攝入了SP青霉素耐藥基因并成功地重組和表達(dá)的結(jié)果。實驗組的特征性抑菌環(huán)帶也間接地支持上述分子機制，因為只有不同的SP標(biāo)準(zhǔn)菌在轉(zhuǎn)化實驗過程中攝入不同種類的青霉素耐藥基因并成功地重組和表達(dá)，使SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為多種青霉素低敏感菌株，才能在抑菌圈外出現(xiàn)銅錢狀的抑菌環(huán)帶。

本研究在抑制轉(zhuǎn)化實驗階段，用DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株，顯示DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用?；谝种妻D(zhuǎn)化實驗后的Optochin試驗陽性結(jié)果，可推斷在抑制轉(zhuǎn)化實驗過程中實驗組和對照組的SP均未受到雜菌污染。依據(jù)抑制轉(zhuǎn)化實驗后的苯唑西林藥敏試驗結(jié)果：實驗組抑菌環(huán)直徑大于對照組(P<0.05)，可推斷DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株。根據(jù)實驗組的抑菌環(huán)帶與對照組相比減弱，也可支持DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株。由于生物大分子DNase不易進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，不可能作用于外源性基因的重組和表達(dá)，很可能作用于外源性基因的轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，因而DNase的分子抑制機制既有DNase隨機剪切外源性SP青霉素耐藥基因以顯示抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，又有DNase特異切割SP青霉素耐藥基因調(diào)控序列以顯現(xiàn)抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的功能[13-15]。

總之，DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，是依次通過外源性DNA提取實驗、SP的轉(zhuǎn)化實驗和SP的抑制轉(zhuǎn)化實驗而揭示。本研究結(jié)果表明，DNase具有阻抑PRSP形成的潛在功能；同時，還表明DNase具有阻抑一些其他耐藥菌形成的潛在作用。本研究結(jié)果將為深入研究DNase阻抑耐藥細(xì)菌形成和開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的藥物提供前期研究及思路。