李征毅 趙永勝 李鋒 劉偉宗 關(guān)弘

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腫瘤，其組織學(xué)類型以甲狀腺乳頭狀癌（PTC）最多，大約占所有甲狀腺癌的70%～90%，其發(fā)生、發(fā)展與基因遺傳、社會因素等相關(guān)，也涉及多種基因的改變[1?3]。高分辨力超聲的發(fā)展使得PTC的檢出率和診斷特異性取得巨大進(jìn)展，但仍存在不足，超聲引導(dǎo)下細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查是目前術(shù)前診斷甲狀腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方法，特異性高，但其最大的缺點(diǎn)在于仍存在約15%～25%細(xì)胞學(xué)不確定性（根據(jù)Bethesda分類法）[4]。

各種基因檢測可提高超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺活組織檢查（活檢）的診斷性能，尤其是BRAF基因突變，因為其在PTC中的高突變率和高特異性而受到更多的關(guān)注[5?6]。許多研究也表明BRAF基因突變與可疑超聲表現(xiàn)存在相關(guān)性。但是，目前較少文獻(xiàn)對PTC的超聲特征與BRAF基因突變之間的關(guān)系進(jìn)行研究，由于腫瘤的徑線不同，導(dǎo)致其表現(xiàn)也多種多樣[7]。因此，本研究對PTC樣本的BRAF基因變異、超聲特征以及病理學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行分析研究。

對象與方法

一、研究對象

收集2016年1月至2017年10月在深圳市第二人民醫(yī)院診斷為PTC或者微小乳頭狀癌的病例247例，病灶最大徑均至少0.5 cm。所有病例均保有完整病理信息、超聲信息和臨床資料，包括一般情況、病理診斷以及必要的免疫組織化學(xué)（組化）信息。所有病例均知情同意，可疑病灶的FNA及BRAF基因檢測均是在手術(shù)之前進(jìn)行。247例患者中，病理細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示190例為PTC，50例為可疑乳頭狀癌，6例為細(xì)胞不典型表現(xiàn)，1例為濾泡性結(jié)節(jié)。其中5例為不典型細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)患者因為具典型PTC超聲征象接受手術(shù)，另外1例行超聲引導(dǎo)下粗針組織學(xué)活檢后證實(shí)為PTC。1例濾泡性結(jié)節(jié)患者，由于超聲引導(dǎo)下引流區(qū)域淋巴結(jié)粗針活檢顯示為來源于甲狀腺的轉(zhuǎn)移癌而接受手術(shù)。

所有患者均接受甲狀腺全切術(shù)或次全切術(shù)，預(yù)防性或者治療性的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。對經(jīng)針吸細(xì)胞學(xué)活檢證實(shí)或術(shù)中發(fā)現(xiàn)具有可疑轉(zhuǎn)移的進(jìn)行頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)清掃。

二、超聲檢查、病理檢查及基因突變檢測

超聲檢查：使用百勝M(fèi)YLAB?TWICE進(jìn)行甲狀腺檢查，線陣探頭，頻率3～13 MHz。超聲掃查為具10年甲狀腺?？品矫娉暯?jīng)驗的醫(yī)師進(jìn)行。所有超聲檢查均在BRAF突變檢測前進(jìn)行。分析以下超聲征象：囊實(shí)性、回聲性質(zhì)（高回聲、等回聲、低回聲以及極低回聲）、鈣化情況（微鈣化，粗大鈣化和無鈣化）及形狀（縱橫比）。超聲表現(xiàn)中微鈣化、形態(tài)不規(guī)則或分葉，極低回聲，長軸垂直于皮膚等認(rèn)為是惡性征象。

病理檢查：全部病例由1～2名高年資病理醫(yī)師重新閱片復(fù)診。病理學(xué)記錄包含患者的性別、年齡等。主要關(guān)注的病理資料：腫瘤的測值，BRAF基因突變檢測結(jié)果，結(jié)節(jié)數(shù)目，是否包膜外侵襲，中央?yún)^(qū)及頸側(cè)區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，根據(jù)第7版的癌癥分期指南進(jìn)行的TNM分期。根據(jù)文獻(xiàn)[8]，將直徑≤1 cm的PTC定義為微小乳頭狀癌。

所有病例根據(jù)樣本自身腫瘤細(xì)胞分布，挑選腫瘤細(xì)胞含量最高的玻片直接封存于1.5 ml EP管中。后經(jīng)二甲苯脫蠟后用天根石蠟包埋組織DNA提取試劑盒 （DP331）提取，具體流程參考試劑盒說明書。所有提取好的樣本DNA均用Thermo NanoDrop 2000進(jìn)行測定濃度，確定樣品無蛋白污染，OD260/OD280=1.8～2.0；提取完的DNA若未立即進(jìn)行檢測，則于-20℃保存。

基因突變檢測：所有樣本DNA均稀釋至50～100 ng/μl后取2μl用北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的B?raf基因突變檢測試劑盒（熒光PCR?毛細(xì)管電泳測序法）（產(chǎn)品號：SMD?01?061）進(jìn)行后續(xù)Braf基因突變檢測。操作流程按照試劑盒說明書進(jìn)行，最終獲得的測序產(chǎn)物取12μl在ABI3500Dx測序儀上機(jī)檢測，檢測操作按照測序儀說明書進(jìn)行。測序數(shù)據(jù)以Snapgene Viewer 4.0.5分析，與正常的人BRAF基因序列（NG_007873.3）中的外顯子15進(jìn)行序列比對，以確定樣本是否存在BRAF V600位置上的突變。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。計算BRAF基因突變率。BRAF基因突變陽性和陰性患者的超聲征象和病理結(jié)果進(jìn)行對比分析。無序分類資料組間比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法，等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PTC與微小乳頭狀癌BRAF突變率比較

247例患者PTC中，103例（41.7%）是甲狀腺微小乳頭狀癌，144例（58.3%）為PTC，其中甲狀腺微小癌組BRAF基因突變發(fā)生率為43.7%（45/103），低于PTC組的70.8%（102/144），2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.362，P＜0.001）。

二、PTC患者BRAF突變與超聲圖像特征分析

BRAF突變陽性病例的PTC病灶在形態(tài)、邊界、邊緣、鈣化、內(nèi)部回聲等方面，與BRAF突變陰性病例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見圖1～3、表1。

圖1 一例PTC患者甲狀腺右側(cè)葉超聲圖

二、PTC患者BRAF突變與病理學(xué)特征分析

與BRAF基因突變陰性PTC患者對比，陽性患者中男性比例似乎更高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.366，P=0.067）。BRAF基因突變陽性的患者更容易出現(xiàn)腫瘤徑線≥10 mm、腺體外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM較高的分期（P均＜0.05）。而多灶性甲狀腺癌則暫時未見與BRAF基因突變有必然聯(lián)系（χ2=0.195，P=0.659），見表2。

圖2 PTC患者BEAF基因測序圖

圖3 PTC患者BEAF基因測序圖

討 論

BRAF基因突變的作用包括下調(diào)抑癌基因和增加促腫瘤生長的因子，其結(jié)果是促進(jìn)腫瘤生長，腫瘤血管的生成，組織侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。除此之外，許多文獻(xiàn)表明BRAF基因突變與不良的預(yù)后之間有直接關(guān)系，如腺體外侵襲、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腫瘤分期較晚和腫瘤復(fù)發(fā)，但這些觀點(diǎn)尚存爭議[9?10]。BRAF基因是一種癌基因，編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。BRAF基因位于7p34，長約190 kb，轉(zhuǎn)錄mRNA長2.5 kb，編碼783氨基酸的蛋白，相對分子質(zhì)量為

94 000～95 000。BRAFV600E基因突變經(jīng)常出現(xiàn)在人類惡性腫瘤中，BRAF突變主要發(fā)生在外顯子15上的激活區(qū)的第1 799氨基酸上（T突變?yōu)锳），導(dǎo)致編碼的氨基酸由谷氨酸變成纈氨酸（V600E），使BRAF激酶活性提高，進(jìn)而通過磷酸化作用使BRAF蛋白激活。BRAFV600E基因突變是甲狀腺癌中最常見的遺傳學(xué)事件，且在PTC中的發(fā)生率最高，達(dá)29%～88%，我們推測這個突變率范圍分布如此之廣的原因可能是PTC的亞型多樣、受試者的背景不一以及研究方法不同。本研究資料所得的突變率為57.9%[11]。

表1 PTC患者BRAF突變與PTC超聲特征分析

表2 PTC患者BRAF基因突變與臨床病理特征相關(guān)性分析

PTC中超聲征象與BRAF基因突變的關(guān)系，多數(shù)學(xué)者的研究傾向于認(rèn)為BRAF基因突變陽性與陰性之間的PTC超聲征象的差異無統(tǒng)計學(xué)意義[12]。韓國學(xué)者針對微小乳頭狀癌的研究也顯示兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[6]。與之不同的是，Kwak等（2009年）針對115例PTC患者BRAF基因突變陽性的研究表明，腫痛徑線大于10 mm的乳頭狀癌與可疑惡性超聲征象以及惡性超聲征象的數(shù)目呈正相關(guān)，但在此研究中，作者也表明，由于甲狀腺微小乳頭狀癌的超聲征象不典型，與良性病灶征象存在重疊而且很難準(zhǔn)確鑒別的。而本研究結(jié)果表明無論腫痛徑線大于等于10 mm或小于10 mm的PTC患者，其超聲征象與BRAF基因突變有關(guān)系。用于對甲狀腺結(jié)節(jié)判讀分類的超聲征象也與BRAF基因突變陽性無明顯關(guān)系，盡管腫痛徑線大于10 mm的PTC患者更傾向于與BRAF基因突變陽性相關(guān)。

我們假設(shè)這個偏差是由于我們的研究人群與前述研究的樣本存在差異引起的，2組患者使用的大多數(shù)可疑惡性的超聲征象是一樣的，因此可能導(dǎo)致BRAF突變陽性和陰性的患者會傾向于在超聲特征上無明顯差別。本研究表明，針對進(jìn)行細(xì)針抽吸活檢的惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的BRAF基因檢測陽性與陰性之間的超聲征象并無差異。

BRAF陽性的PTC的結(jié)節(jié)徑線，無論是超聲測值的或者是病理測量的均較BRAF陰性組的要大一些。之前的研究報道BRAF突變與腫瘤大小之間存在關(guān)系，這似乎表明BRAF突變陽性可導(dǎo)致腫瘤的增長與侵襲性。然而，本研究結(jié)果與此不同，結(jié)果顯示BRAF突變與腫瘤大小之間的關(guān)系存在爭議。我們的結(jié)果也顯示BRAF突變在男性中更易出現(xiàn)，這點(diǎn)與之前的研究一致。

既往的研究表明PTC病理特點(diǎn)中有一項或多項高危指標(biāo)與BRAF基因突變相關(guān)[13]。本研究的結(jié)果與最近的薈萃分析和大樣本調(diào)查結(jié)果一樣，也表明甲狀腺腺體外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的比例更高等均與BRAF基因突變相關(guān)。此外，最近一項隨訪15年的研究表明BRAF基因突變與腫瘤更高的分期、血管侵犯以及病死率相關(guān)。但也有學(xué)者研究結(jié)果與之相反，認(rèn)為它們之間并無相關(guān)性。究其原因，得出相悖的結(jié)論可能是由于研究樣本中PTC的亞型不一，而本研究中所選擇病例均為同一亞型的PTC；此外，地理、人文倫理因素、就診時疾病所處發(fā)展的時期不同均存在影響，另外BRAF分析的方法不同以及預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃的指征把握不一均有影響[14]。

結(jié)合本組數(shù)據(jù)的結(jié)果與其它學(xué)者的前期工作，可將BRAF基因突變應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，初步認(rèn)為可包括以下2個方面：①利用BRAF基因突變檢測提高術(shù)前PTC的臨床診斷，結(jié)合超聲介入與基因檢測，對未能確診的甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本進(jìn)行BRAF基因突變檢測，期望可以幫助提高PTC的確診率；②利用BRAF基因突變檢測協(xié)助術(shù)前評估和處理方案制訂，研究結(jié)果表明BRAF基因突變與PTC腺體外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)，因此BRAF基因突變可作為預(yù)測腫瘤預(yù)后的早期、有效方法之一。術(shù)前檢測FNA標(biāo)本的BRAF基因突變可能是輔助術(shù)前風(fēng)險分級、決定手術(shù)方式和制訂術(shù)后治療和隨訪策略的重要手段。這有助于平衡PTC治療的益處和風(fēng)險，尤其是無影像學(xué)證據(jù)幫助時，決策淋巴結(jié)是否清掃以及清掃區(qū)域，達(dá)到既減少PTC的復(fù)發(fā)又減少治療副作用的最佳平衡。

綜上所述，PTC患者BRAF基因突變率較高，突變陽性與否與甲狀腺癌的超聲圖像特征無相關(guān)性；而與多項病理特點(diǎn)相關(guān)，利用研究的結(jié)果，可幫助提高PTC的確診率以及協(xié)助術(shù)前評估和處理方案制訂。本研究尚存部分不足之處：受研究時間的限制，未對術(shù)后患者長時間隨訪；未評估不同超聲醫(yī)師之間對病灶描述可能存在的差異；未利用新興的彈性成像技術(shù)增加對病灶的評估。