朱德強(qiáng)，陳學(xué)軍

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室, 遼寧 錦州121000)

索拉菲尼作為肝癌臨床一線藥物，能夠抑制酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸等多種激酶[1]，有效抑制細(xì)胞的增殖。但隨著藥物的長(zhǎng)期使用，臨床已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象[2]，降低了索拉菲尼的治療效果，急需尋找一種藥物聯(lián)合使用以增強(qiáng)其療效。白花丹素(plumbagin,PLB)作為一種中藥單體，研究[3-5]已證實(shí)PLB能夠明顯抑制食管癌、鼻咽癌、肺癌和前列腺癌等細(xì)胞的增殖。Pan等[6]研究顯示PLB可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生 G/M 期阻滯，引起其生長(zhǎng)受限。Checker等[7]發(fā)現(xiàn):PLB能夠上調(diào)淋巴瘤細(xì)胞中caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和磷酸化組蛋白的表達(dá)水平，破壞 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，使得腫瘤細(xì)胞增殖受抑。研究[8]證明：PLB能升高癌癥細(xì)胞中ROS水平，但PLB在肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞中的作用及機(jī)制尚未可知。本研究建立肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2R，觀察PLB對(duì)耐藥細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其對(duì)耐藥細(xì)胞的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。索拉菲尼(Sorafenib)和PLB購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，MTT 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，結(jié)晶紫染色液、Hoechst33342染色、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體和兔抗人單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。CO2孵育箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，細(xì)胞流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)LEICA公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM 培養(yǎng)基中(含10%FBS、100 IU·mL-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素、pH 7.2～7.4)，置于 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化，每隔2 d以 1∶3 比例傳代，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。索拉菲尼和PLB分別溶于二甲基亞砜( DMSO)中，存儲(chǔ)濃度為10 mmol·L-1，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用，無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋使用。采用逐步提高索拉菲尼濃度持續(xù)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立耐藥細(xì)胞株HepG2R,藥物濃度依次為2、5、8、11、14、17和19 μmol·L-1，反復(fù)誘導(dǎo)12周，細(xì)胞最終在19 μmol·L-1藥物濃度的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。將HepG2R細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、索拉菲尼(5 μmol·L-1)組、PLB(2 μmol·L-1)組、索拉菲尼(5 μmol·L-1)聯(lián)合PLB(2 μmol·L-1)組(聯(lián)合組)。

1.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 檢測(cè)各組藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。將處于對(duì)數(shù)增殖期的HepG2和HepG2R細(xì)胞鋪至96孔培養(yǎng)板，每孔約6 000個(gè)細(xì)胞，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，以不含藥物處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入MTT( 5 g·L-1) 溶液，每孔20 μL MTT和80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng) 4 h，輕輕抽掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩10 min，促使細(xì)胞中甲瓚充分溶解，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔內(nèi)吸光度(A) 值，計(jì)算各組細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=給藥組A值/空白組A值×100%；繪制細(xì)胞活力圖，計(jì)算HepG2和HepG2R細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的半數(shù)抑制濃度(IC50)值；采用同樣操作，檢測(cè)不同濃度PLB作用48 h時(shí)和2 μmol·L-1PLB處理不同時(shí)間時(shí)各組細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞活力直條圖。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的克隆形成率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2R細(xì)胞，鋪6孔板，每孔細(xì)胞約5×105個(gè)，根據(jù)分組情況進(jìn)行藥物處理,藥物作用時(shí)間約為2周。待陰性對(duì)照組細(xì)胞長(zhǎng)滿，取出細(xì)胞，PBS 輕輕漂洗2次；以5%甲醛固定30 min，PBS 輕輕漂洗3次；結(jié)晶紫染色 30 min，PBS漂洗3次；晾干照相；計(jì)算克隆形成率。克隆形成率=給藥組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Hoechst33342實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡形態(tài)表現(xiàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)HepG2R細(xì)胞，以胰蛋白酶消化，均勻鋪在12 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，各組分別加入相應(yīng)藥物作用48 h，棄去培養(yǎng)液，以PBS 漂洗3次，加入 Hoechst33342染色液(1 mg·L-1)，避光 37℃孵育20 min，以PBS 漂洗，熒光顯微鏡隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行觀察并照相。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM )檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2R細(xì)胞，均勻鋪在6孔板中培養(yǎng)。按各藥物分組，藥物處理48 h后消化、離心，預(yù)冷PBS重懸，將細(xì)胞密度調(diào)至細(xì)胞 1×105mL-1，按 Annexin Ⅴ-FETC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平 各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用 48 h后，PBS漂洗2次，消化、離心；采用 RIPA 緩沖液(含1% NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1% SDS、0.1%PMSF)裂解；按照 BCA 定量說(shuō)明書(shū)定量；SDS-PAGE 電泳；PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，1% BSA封閉 1 h；一抗(1∶1 000 稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3次，每次10 min；洗膜，二抗(1∶1 000)室溫孵育 1 h，TBST 洗滌3次；ECL 顯影，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。各蛋白相對(duì)表達(dá)水平=給藥組灰度值/對(duì)照組灰度值，Bax/Bcl-2比值=給藥組Bax灰度值/給藥組Bcl-2灰度值。

1.8 各組細(xì)胞中ROS水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2R細(xì)胞，胰蛋白酶消化，均勻鋪于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，各組分別加入相應(yīng)藥物作用48 h，按照ROS檢測(cè)試劑盒操作并照相，計(jì)算ROS水平。ROS水平=實(shí)驗(yàn)組綠色熒光細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組綠色熒光細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的建立和鑒定 小劑量持續(xù)給藥建立肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2R，MTT法檢測(cè)索拉菲尼對(duì)正常肝癌細(xì)胞株HepG2和耐藥細(xì)胞株HepG2R增殖的抑制作用，以細(xì)胞活力為縱軸、以藥物梯度為橫軸繪制藥效曲線，見(jiàn)圖1。耐藥細(xì)胞株HepG2R對(duì)索拉菲尼的IC50值是HepG2的4.5倍(P=0.025)，耐藥細(xì)胞株建立成功，見(jiàn)圖2。

2.2 不同條件下各組細(xì)胞活力 PLB(0 μmol·L-1)處理細(xì)胞時(shí)，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)處理細(xì)胞對(duì)HepG2R細(xì)胞活力無(wú)影響(P=3.579)；PLB(1 μmol·L-1)處理細(xì)胞時(shí)，與未加索拉菲尼組比較，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后細(xì)胞活力降低(P=0.032)；PLB (2 μmol·L-1)處理細(xì)胞時(shí)，與未加索拉菲尼組比較，加入索拉菲尼(5 μmol·L-1)后細(xì)胞活力降低(P=0.006)；隨著PLB濃度升高，HepG2R細(xì)胞對(duì)索拉菲尼敏感性升高，見(jiàn)圖3A。藥物作用24 h,與索拉菲尼組比較,聯(lián)合組細(xì)胞活力降低(P=0.029)；藥物作用48 h后，與索拉菲尼組比較,聯(lián)合組細(xì)胞活力明顯降低(P=0.000)；藥物作用48 h，與PLB組比較，聯(lián)合組細(xì)胞活力降低(P=0.012)，見(jiàn)圖3B。

圖1 HepG2和HepG2R細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的藥效曲線

Fig.1 Pharmacodynamic curves of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

*P<0.05 compared with HepG2 cells.

Fig.2 IC50values of HepG2 and HepG2R cells for sorafenib

2.3 各組細(xì)胞克隆形成率 作用2周后，聯(lián)合組細(xì)胞克隆形成率(58.29%±1.16%)明顯低于索拉菲尼組(88.32%±2.06%)和PLB組(81.65%±1.32%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.021)。見(jiàn)圖4和5。

*P<0.05 compared with PLB (without sorafenib) group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with sorafenib group；#P<0.05 compared with PLB group.

圖3 不同濃度PLB作用48 h時(shí)(A)和2 μmol·L-1PLB作用不同時(shí)間時(shí)(B)各組細(xì)胞活力

Fig.3 Cell vitalities in various groups after treated with different concentrations of PLB at 48 h after treatment (A) and treated with 2 μmol·L-1PLB for different treatment time

2.4 各組細(xì)胞細(xì)胞核凋亡形態(tài)表現(xiàn) Hoechst 33342染色結(jié)果顯示：各組藥物作用48 h后，對(duì)照組細(xì)胞核淡染，索拉菲尼組和PLB組細(xì)胞核少部分濃染、明亮，聯(lián)合組細(xì)胞核大部分濃染，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、明亮。見(jiàn)圖6(插頁(yè)五)。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率 聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率(35.92%±1.02%)明顯高于索拉菲尼組(7.16%±0.83%)和PLB組(9.27%±0.97%)(P=0.003，P=0.001)。見(jiàn)圖 7。

2.6 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值 各組藥物作用48 h后，Western blottiing法檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。與索拉菲爾組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.000，P=0.001)；與PLB組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中cleaved Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值升高(P=0.001，P=0.002)。見(jiàn)圖8和9。

2.7 各組細(xì)胞中ROS水平 對(duì)照組、PLB組和索拉菲尼組細(xì)胞中ROS水平較低，聯(lián)合組細(xì)胞中ROS水平明顯高于索拉菲尼組(P=0.002)和PLB組(P=0.005)。見(jiàn)圖10(插頁(yè)五)和圖11。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

圖4 各組細(xì)胞克隆形成情況

Fig.4 Clone formation of cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.05 compared with PLB group.

圖5 各組細(xì)胞克隆形成率

Fig.5 Clone formation rates of cells in various groups

3 討 論

肝細(xì)胞癌作為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率居高不下，臨床多以手術(shù)治療為主，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)[2, 9]，一些化療藥物的出現(xiàn)延緩了肝癌的進(jìn)展，緩解了病情。索拉菲尼作為肝癌臨床治療的一線化療藥物，能有效地抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體，還能抑制受體酪氨酸激酶血管表皮生長(zhǎng)因子受體 2、網(wǎng)織紅細(xì)胞以及酪氨酸激酶受體等，從而阻止腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成,但是肝癌索拉菲尼耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重限制其治療效果和應(yīng)用。

A:Control group; B:Sorafenib group; C:PLB group; D:Combination group.

肝癌對(duì)索拉菲尼耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，隨著耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，藥物療效的不斷下降，急需尋找一種化療增敏劑來(lái)抵抗藥物耐受。研究[10-12]顯示：天然藥物PLB具有良好的抗腫瘤作用，PLB來(lái)源于白花丹的根部提取物，對(duì)前列腺癌、乳腺癌和肺癌等具有良好的治療效果。研究[13]顯示：PLB能提高腫瘤細(xì)胞ROS水平，使腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。PLB還可降低急性髓性白血病HL-60細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平，增加 Bax 表達(dá)水平，明顯升高caspase-3表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Lane 1:Control group; Lane 2:Sorafenib group; Lane 3:PLB group; Lane 4:Combination group.

圖8 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.8 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in cells in various groups

*P<0.01 compared with sorafenib group；△P<0.01 compared with PLB group.

圖9 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Fig.9 Expression levels of apoptosis-related proteins in cells in various groups

圖11 各組細(xì)胞中ROS水平

氧化應(yīng)激是體內(nèi)微環(huán)境改變導(dǎo)致的一種氧化反應(yīng)，引起大量氧化中間產(chǎn)物的形成，其中ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過(guò)氧化氫(H2O2)等，體內(nèi)多種疾病的發(fā)生均與之有關(guān)[14-17]。文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道：ROS水平升高能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與降低細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān)，細(xì)胞因缺少ATP會(huì)引起自噬。自噬作為細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)[20- 23]，細(xì)胞本身吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，藉此實(shí)現(xiàn)本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)索拉菲尼小劑量持續(xù)給藥培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，制備耐藥細(xì)胞模型HepG2R，采用MTT實(shí)驗(yàn)確定藥物作用濃度和時(shí)間，根據(jù)篩選的藥物濃度和時(shí)間進(jìn)行分組，比較各組細(xì)胞增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)PLB能明顯增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性，并且提高耐藥細(xì)胞中ROS水平，與既往研究結(jié)論相符。

本研究為臨床肝癌索拉菲尼耐藥的治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍存在諸多不足，未來(lái)應(yīng)該進(jìn)行更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究探討耐藥細(xì)胞增敏的具體機(jī)制，為臨床治療肝癌耐藥提供一個(gè)新方案。