王 陽，曹志華，牛桂林，劉 磊，朱 清，胡躍世，李 征

(南陽市中心醫(yī)院泌尿外科，河南南陽 473000)

前列腺癌是歐美地區(qū)男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是導致發(fā)達國家男性癌癥相關死亡的重要原因。近年來，前列腺癌在中國的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢[1-2]。因前列腺癌發(fā)病部位隱匿，大部分患者確診時已發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，喪失手術良機，而長期抗雄激素治療則導致前列腺癌由雄激素敏感性逐漸進展為去勢抵抗性，預后極差?；蛑委熍c分子靶向治療是目前新興起的癌癥治療方法[3]。紡錘體和動粒相關蛋白1(spindle and kinetochore associated protein 1，SKA1)與SKA2、SKA3共同構成三元復合物SKA，是動粒與微管蛋白結合所必需的成分。SKA復合物在真核生物的有絲分裂過程中發(fā)揮關鍵作用，為真核生物生長、發(fā)育的基礎。多項研究顯示[4-6]，SKA1在腫瘤生長過程中發(fā)揮重要作用，SKA1沉默可影響非小細胞肺癌、肝細胞癌、胃癌等多種癌細胞的惡性增殖，抑制其周期進程。但SKA1與前列腺癌的相關性研究鮮有報道。本研究通過慢病毒載體介導的RNAi技術來沉默前列腺癌PC-3細胞中SKA1的表達，觀察其對PC-3細胞增殖以及細胞周期進程的影響，探討其治療前列腺癌的潛在價值。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑去勢抵抗性前列腺癌PC-3細胞以及人類胚胎腎細胞系293T購自中國科學院細胞庫(上海，中國；慢病毒載體pLVTHM購自武漢淼靈生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；PCR引物購自上海生工公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購自北京博邁斯生物公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；熒光定量PCR試劑盒購自寶生物大連公司；兔多克隆抗體SKA1、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent protein kinases 4，CDK4)、cyclinD1購自美國Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP購自上海碧云天生物公司；噻唑藍(MTT)試劑盒購自上海歌凡生物公司；MX-3000P熒光定量PCR儀和EPICSXL流式細胞儀購自Beckman Couhe公司。

1.2細胞培養(yǎng)及傳代取適量PC-3細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次，一般傳至3～5代，處于對數(shù)生長期的細胞可用于轉(zhuǎn)染。293T細胞在Dulbecco改良的含10%FBS的Eagle’s培養(yǎng)基(Hyclone)中孵育，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3慢病毒表達載體Lv-shSKA1的構建、包裝及滴度測定根據(jù)GenBank提供的人SKA1 基因的mRNA序列(NM_001039535)，利用siRNA設計軟件(http：//jura．wi．mit．Edu/bioc/siRNAext/home．Php)設計3條siRNA序列，根據(jù)抑制效率，確定抑制效率最高的SKA1序列，添加EcoRⅠ、XmaⅠ酶切位點，其siRNA引物序列為：上游5′-GGCTggatccATGGCCTCGTCAGATCTGGAAC-3′，下游為5′-AAGGCCCGGGGGTTATAACATAACGAGTAAGT-3′，引物序列由上海生工公司合成。用EcoRⅠ、XmaⅠ雙酶切慢病毒載體pLVTHM，用T4連接酶將SKA1目的片段與慢病毒表達載體連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α。篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進行PCR鑒定，然后送往上海生工進行測序。將重組質(zhì)粒及慢病毒包裝質(zhì)粒用Lipofectami 共同轉(zhuǎn)染至293T 細胞，轉(zhuǎn)染8 h后，棄去含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基，換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心，過濾，并進行滴度測定。

1.4慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞取處于對數(shù)生長期的PC-3細胞，接種于6孔板，每孔約5×104個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%～80%時開始轉(zhuǎn)染，操作步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。將PC-3細胞分別與含20 μL Lv-shSKA1慢病毒或Lv-shCon的轉(zhuǎn)染試劑共培養(yǎng)4 d后，熒光顯微鏡下檢測GFP表達，評估感染效率。

1.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染4 d后，收集各組(空白組、Lv-shCon組和Lv-shSKA1組)PC-3細胞，利用Trizol法提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度計檢測其純度及濃度。取1.0 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取5 μL稀釋20倍的cDNA為模板，加入10 μL SYBR Green qPCR Super Mix(2×)、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ(50×)、0.5 μL上下游引物，最后加ddH2O至20 μL，在實時熒光定量PCR儀上擴增。反應條件：95 ℃ 45 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。實驗進行3次生物學重復，以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR結果，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt實驗組- ΔCt對照組。siRNA干涉效率=(2-ΔΔCt目的基因-2-ΔΔCt內(nèi)參基因) / 2-ΔΔCt目的基因× 100%。引物序列見表1。

表1 SKA1和GAPDH引物序列

1.6蛋白質(zhì)印跡(Westernblot) 轉(zhuǎn)染4 d后，收集各組(空白組、Lv-shCon組和Lv-shSKA1組)PC-3細胞，按常規(guī)步驟提取細胞蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，并調(diào)節(jié)好蛋白濃度。每組取50 μg蛋白樣品，與適量上樣緩沖液混合，煮沸變性；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液，避光封閉1 h；TBST漂洗后，將膜置于一抗稀釋液(兔多克隆抗體SKA1、CDK4、cyclin D1按1∶1 000稀釋)中，4 ℃孵育過夜；次晨TBST漂洗后，置于二抗稀釋液(山羊抗兔IgG溶液按1∶1 000稀釋)中，室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍；將發(fā)光液均勻加在膜上，反應5 min，置于暗盒中曝光、顯影和定影。使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.7MTT法檢測細胞增殖收集各組慢病毒干擾5 d的PC-3細胞，按每孔1.0×105個細胞接種至96孔培養(yǎng)板，每組設置5個復孔。在37℃、5%CO2孵箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4和5 d。培養(yǎng)終止前4 h每孔加入20 μL MTT液(5 mg/mL，用PBS溶解)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心棄去上清，向每孔加入150 μL DMSO，振蕩溶解結晶。采用酶標分析儀在595 nm波長處檢測各孔的吸光度(A595)值。

1.8流式細胞儀檢測細胞周期收集各組慢病毒干擾5 d的PC-3細胞，按每孔1.0×105個細胞接種至6 cm培養(yǎng)皿，每組設置3個重復。待細胞覆蓋率達80%時，棄掉培養(yǎng)液，收集細胞；D-Hanks漂洗1遍，胰酶消化后終止，收集細胞；4 ℃預冷PBS漂洗1遍，收集細胞；100 μL PBS重懸細胞，用900 μL 4 ℃預冷70%乙醇4 ℃固定1 h；棄掉固定液，PBS漂洗，加入20 μL PI染色液，4 ℃避光孵育30 min；PBS漂洗，過濾，用EPICSXL流式細胞儀進行數(shù)據(jù)采集并分析。

2 結 果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染后PC-3細胞的形態(tài)觀察感染72 h后，熒光顯微鏡檢測Lv-shSKA1慢病毒感染PC-3細胞情況。結果發(fā)現(xiàn)，Lv-shCon組和Lv-shSKA1組細胞GFP陽性率均達80%以上，說明重組慢病毒Lv-shSKA1對PC-3細胞具有較好的親嗜性(圖1)。

圖1熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后PC-3細胞形態(tài)(×10)

Bright：明場視野；GFP：綠色熒光視野。

2.2轉(zhuǎn)染PC-3細胞SKA1mRNA表達水平qRT-PCR結果顯示，SKA1 mRNA在空白組與Lv-shCon組細胞中的表達水平差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，SKA1 mRNA在Lv-shSKA1組細胞中表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2)。

2.3轉(zhuǎn)染PC-3細胞SKA1蛋白表達水平Western blot結果顯示，SKA1蛋白在空白組與Lv-shCon組細胞中的表達水平差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，SKA1蛋白在Lv-shSKA1組細胞中表達水平顯著下調(diào)(P<0.05，圖2、表2)。

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后SKA1 mRNA相對表達水平及相對灰度值

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后SKA1 mRNA相對表達水平及相對灰度值

組別SKA1(2-ΔΔCt)水平SKA1灰度空白組1.03±0.130.407±0.018Lv-shCon組0.98±0.210.396±0.011Lv-shSKA1組0.26±0.07?0.294±0.038?F值42.25330.828P值0.000 0.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后SKA1蛋白表達

2.4慢病毒轉(zhuǎn)染對PC-3細胞增殖的影響MTT實驗結果顯示，空白組與Lv-shCon組細胞增殖速率差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組細胞增殖速率顯著較慢(P<0.05，表3)。

表3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后不同時間點的A595值

表3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后不同時間點的A595值

組別1 d2 d3 d4 d5 d空白組0.324±0.0050.510±0.0080.592±0.0210.872±0.0241.196±0.023Lv-shCon組0.322±0.0070.502±0.0120.576±0.0180.865±0.0211.184±0.018Lv-shSKA1組0.325±0.0040.501±0.0060.516±0.017?0.587±0.015?0.580±0.012?F值0.3891.49622.846319.159166.640P值0.6860.2630.0000.0000.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

2.5慢病毒轉(zhuǎn)染對PC-3細胞周期分布的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組G0/G1期細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，S期細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，大部分細胞停滯于S期(表4)。

表4 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后各組G0/G1、S、G2/M、sub-G1所占百分比

表4 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后各組G0/G1、S、G2/M、sub-G1所占百分比

組別G0/G1SG2/M空白組61.73±1.5829.61±2.5811.53±1.08Lv-shCon組60.46±0.9631.58±0.8612.11±0.73Lv-shSKA1組48.84±1.68?39.36±1.49?12.81±0.52F值121.30241.4603.128P值0.0000.0000.081

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

2.6慢病毒轉(zhuǎn)染對PC-3細胞CDK4、cyclinD1蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與Lv-shCon組比較，Lv-shSKA1組細胞CDK4、cyclin D1蛋白表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05，圖3、表5)。

表5 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后CDK4、cyclin D1蛋白表達相對灰度值

表5 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后CDK4、cyclin D1蛋白表達相對灰度值

組別CDK4cyclinD1空白組0.431±0.0260.413±0.014Lv-shCon組0.425±0.0180.406±0.024Lv-shSKA1組0.305±0.015?0.312±0.021?F值61.861 39.336P值0.0000.000

與Lv-shCon組比較，*P<0.05。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3細胞后CDK4、cyclinD1蛋白表達

3 討 論

前列腺癌早期患者主要以根治性手術切除為主，中晚期患者則以內(nèi)分泌治療-雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)為主。治療初期，ADT治療對多數(shù)患者效果明顯，但隨著治療時間的延長，多數(shù)患者均會進展成去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)，縮短患者生存期[7-8]。因此，探索CRPC的分子發(fā)生機制，尋找其關鍵作用靶點，將為靶向治療提供新的實驗證據(jù)。PC3細胞株是一種從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤中分離出來的雄激素非依賴性前列腺癌細胞株，目前被廣泛用于去勢抵抗型前列腺癌的基礎和臨床研究[9]。近年來，RNA干擾技術成為廣泛用于研究腫瘤細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及細胞周期的一種分子生物學工具，用于腫瘤的基因靶向治療具有極大的臨床應用前景。本研究中我們應用慢病毒介導的RNAi抑制SKA1在前列腺癌PC-3細胞中的表達，初步研究其在前列腺癌中的功能和作用，為后期的靶向治療提供理論依據(jù)。

紡錘體和動粒相關蛋白1(SKA1)是近期發(fā)現(xiàn)的、與有絲分裂密切相關的基因，是動粒結合微管蛋白必不可少的組成部分，其表達異常可造成紡錘體檢測點發(fā)生缺陷，在細胞周期調(diào)控和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。SKA1在乳頭狀甲狀腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胃癌、腎癌、前列腺癌等多種癌組織中的表達均顯著癌旁正常組織，與臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、侵襲等密切相關，參與了相關腫瘤的細胞增殖進程[ 10-12]。然而SKA1與前列腺癌的相關性研究鮮有報道，是否也發(fā)揮類似作用，尚不得而知。本研究中我們采用shRNA干擾技術下調(diào)SKA1表達，并應用MTT檢測SKA1下調(diào)對前列腺癌細胞增殖的影響，結果顯示，Lv-shSKA1組細胞增殖速率慢于Lv-shCon組，說明慢病毒介導的SKA1沉默能夠抑制前列腺癌PC-3細胞的體外增殖，與他人研究結果類似[ 13-14]，提示SKA1在前列腺癌增殖過程中也發(fā)揮重要作用。

細胞周期失控是腫瘤形成的關鍵因素。SKA1是一種重要的微管結合蛋白，與SKA2、SKA3組成蛋白復合物SKA，對微管蛋白的解聚起著調(diào)控作用，使染色體移向兩級，保證細胞順利進行有絲分裂，防止產(chǎn)生非整倍體。細胞增殖過程中非整倍體的產(chǎn)生是絕大部分惡性腫瘤的共同特征[15-16]。SKA1缺乏可造成染色體分離異常，而過表達則可造成細胞間期微管成核，其缺乏或過表達均對有絲分裂的正常進程造成嚴重影響。SKA復合物或其成分缺乏可造成染色體排列不整齊或延遲，導致有絲分裂在分裂中期停滯，而不能進入分裂后期[17-18]。學者研究顯示，SKA1缺乏使胃癌MGC80-3細胞周期阻滯在S期，進而抑制增殖[19]。本研究中我們的研究結果與其一致，流式檢測結果顯示，SKA1基因沉默后G0/G1期細胞數(shù)顯著減少，S期細胞數(shù)顯著增加，即大量細胞在S期停滯，表明SKA1能夠影響細胞的周期分布，可能是造成腫瘤細胞惡性增殖的一個重要原因，SKA1有望成為治療前列腺癌的靶標基因。

迄今為止，SKA1沉默抑制腫瘤細胞增殖和細胞周期進程的的分子機制尚不明確，因此，我們進一步研究SKA1沉默對細胞周期相關蛋白的影響。CDK4、cyclin D1是影響腫瘤細胞周期進程的2個關鍵調(diào)控分子，cyclin D1是G1期的細胞周期蛋白，與CDK4在G1期結合成復合物，接著在氨基端與視網(wǎng)膜母細胞瘤編碼蛋白pRb結合并使其磷酸化，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，調(diào)控細胞由G1期進入S期，對細胞的分裂增殖起著促進作用[20-21]。本研究中我們的結果顯示，，SKA1基因表達沉默后，前列腺癌PC-3細胞中CDK4、cyclin D1蛋白表達顯著下調(diào)，這與QIN等[5]在肝癌中的研究結果類似，因此，我們有理由推測SKA1敲低后抑制前列腺癌細胞生長的機制可能部分通過下調(diào)CDK4和Cyclin D1的表達來實現(xiàn)的。

總之，這些研究結果表明SKA1可能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白在前列腺癌細胞生長中發(fā)揮重要作用，慢病毒介導的SKA1 沉默將會和其他分子標志物一樣成為治療前列腺癌的新的治療策略。不過本研究只是對SKA1在前列腺癌中的功能及下游調(diào)控蛋白進行初步研究，研究層面尚淺，后續(xù)還需繼續(xù)從機制上進行深入研究。