李 鑫，張秀麗，赫 捷

(1.朝陽市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，朝陽 122000；2.朝陽市第二醫(yī)院，朝陽 122000)

益母顆粒是由益母草、當(dāng)歸、川芎和木香制成，具有活血調(diào)經(jīng)、行氣止痛的功效，主治氣滯血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)和產(chǎn)后瘀血腹痛等癥，是常用的中成藥，被收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第九冊(cè)。該標(biāo)準(zhǔn)只有性狀鑒別及檢查項(xiàng)，為有效控制該品種的質(zhì)量，增加了方中木香、當(dāng)歸、川芎和益母草的TLC法，建立了方中當(dāng)歸、川芎所含阿魏酸的含量測(cè)定方法,該方法可行，可提高益母顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1-10]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-2010A HT高效液相色譜儀(日本島津公司)；CPA225D型電子天平，BSA224S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；9860A型超聲波清洗器(天津市科貝爾光電技術(shù)有限公司)。

1.2試藥 益母顆粒(批號(hào)：170607，160116和160205，修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；阿魏酸、鹽酸水蘇堿、當(dāng)歸、川芎和木香(批號(hào)分別為：110773-201313，110712-201614，120927-201516，120918-201612和120921-201309)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇均為色譜純(西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)；磷酸為分析純(天津永大化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 定性分析

2.1益母草的鑒別

2.1.1供試品溶液 取益母顆粒粉末7 g，加15 mL沸水溶解，加稀鹽酸使pH值調(diào)至1～2，通過陽離子交換樹脂柱(732鈉型，內(nèi)徑為2 cm，柱高為15 cm)，依次用水洗脫至洗脫液無色，棄去，再用250 mL氨溶液(2→13)作為洗脫液，收集于器皿中，蒸干得殘?jiān)?，再? mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解，即得。

2.1.2陰性對(duì)照溶液 按照益母顆粒處方的制備方法，得到缺益母草的制劑，再按照2.1.1項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.3鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液 取鹽酸水蘇堿2.13 mg，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇1 mL，溶解，即得。

2.1.4薄層層析 在同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，用丙酮-無水乙醇-鹽酸(10∶6∶1)溶液展開，取出，揮干展開劑，薄層板于105 ℃加熱15 min使薄層板上殘留鹽酸完全揮盡，放冷，噴顯色劑為稀碘化鉍鉀試液-三氯化鐵試液(10∶1)的混合液至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液與對(duì)照品溶液的薄層色譜顯相同斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液的薄層色譜無相應(yīng)斑點(diǎn)[11]，見圖1A。

2.2當(dāng)歸、川芎的鑒別

2.2.1供試品溶液 取益母顆粒粉末14 g，用30 mL的乙醚回流30 min，取濾液揮干，用1 mL乙醇溶解，即得。

2.2.2陰性對(duì)照溶液 按照益母顆粒處方工藝，得到缺當(dāng)歸、川芎的制劑，再按照2.2.1項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.3對(duì)照品溶液 分別稱取當(dāng)歸、川芎1 g，再按照2.2.1項(xiàng)下方法分別制成當(dāng)歸和川芎對(duì)照品溶液。

2.2.4薄層層析 在同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照品溶液各2 μL，用正己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶液展開，取出，揮干展開劑，在紫外光燈365 nm處觀察。供試品溶液與當(dāng)歸、川芎對(duì)照品溶液的TLC色譜顯相同斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液的TLC色譜無相應(yīng)斑點(diǎn)[11-12]，見圖1B。

2.3木香的鑒別

2.3.1供試品溶液 取益母顆粒粉末15 g，將30 mL甲醇作為溶劑，超聲30 min，取出，濾液揮干至5 mL，即得。

2.3.2陰性對(duì)照溶液 按照益母顆粒處方工藝，得到缺木香的制劑，再按照2.3.1項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.3對(duì)照品溶液 稱取木香0.5 g，用甲醇10 mL作為溶劑,超聲30 min，濾液作為木香對(duì)照溶液。

2.3.4薄層層析 在同一硅膠G薄層板上分別點(diǎn)供試品溶液、陰性對(duì)照溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，用環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上層液展開，取出，揮干展開劑，薄層板上噴10 mL·L-1香草醛硫酸溶液，加熱，使薄層板上斑點(diǎn)清晰。供試品溶液與木香對(duì)照品溶液的TLC色譜顯相同斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液的TLC色譜無相應(yīng)斑點(diǎn)[13-14]，見圖1C。

圖1TLC圖

A.益母草:1.陰性對(duì)照；2.鹽酸水蘇堿對(duì)照品；3.供試品。B.當(dāng)歸、川芎:1.陰性對(duì)照；2.當(dāng)歸對(duì)照藥材；3.川芎對(duì)照藥材；4供試品。C.木香:1.陰性對(duì)照；2.木香對(duì)照藥材；3.供試品。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Leonurusartemisia:1.negative control；2.stachydrine hydrochloride sample；3.sample.B.AngelicasinensisandLigusticumchuanxiongHort:1.negative control；2.Angelicasinensissample;3.LigusticumchuanxiongHort sample；4.sample.C.Radixaucklandiae:1.negative control；2.Radixaucklandiaesample；3.sample.

3 含量測(cè)定

3.1色譜條件與溶液的制備

3.1.1色譜條件 Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)(13∶87)；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：316 nm。色譜圖見圖2。

圖2益母顆粒的HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.缺當(dāng)歸、川芎陰性樣品；1.阿魏酸。

Fig.2 HPLC chromatograms of Yimu Granules

A.reference substance；B.sample；C.the sample withoutAngelicasinensisandLigusticumchuanxiongHort；1.ferulic acid.

3.1.2供試品溶液 取益母顆粒，研細(xì)，取細(xì)粉4 g，精密稱定，移至50 mL碘量瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，常溫下再稱定質(zhì)量，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.3阿魏酸對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸適量，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇，制成質(zhì)量濃度為0.014 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

3.1.4陰性對(duì)照溶液 按照《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第九冊(cè)益母顆粒的處方工藝，制成缺當(dāng)歸和川芎藥材的陰性對(duì)照樣品，再按照3.1.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.2系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

3.2.1線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對(duì)照品2.87 mg,置于100 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成質(zhì)量濃度為28.7 μg·mL-1的對(duì)照溶液，精密吸取對(duì)照溶液0.5，1，2，3，4和5 mL，置于10 mL量瓶中，按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度(x)對(duì)色譜峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=65 616x-8 751(r=0.999 5)，阿魏酸質(zhì)量濃度在1.435～14.35 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)160205)，室溫條件下放置，按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每隔4 h進(jìn)樣1針(0～24 h)。結(jié)果供試品溶液中，阿魏酸峰面積的RSD值為0.3%，表明供試品溶液中阿魏酸在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

3.2.3精密度實(shí)驗(yàn) 取3.1.3項(xiàng)下制備的阿魏酸對(duì)照品溶液，按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果阿魏酸峰面積的RSD值為0.2%，表明分析所用儀器的精密性良好。

3.2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取益母顆粒(批號(hào)160205),按照供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，制備6份，按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每份供試品溶液進(jìn)樣2次。結(jié)果阿魏酸峰面積的RSD值為0.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.5加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取益母顆粒(批號(hào)160205)細(xì)粉，每份2 g，共9份。分別加入低、中和高質(zhì)量濃度阿魏酸對(duì)照品溶液1 mL，各3份，按照供試品溶液方法進(jìn)行制備，按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1阿魏酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of the ferulic acid recovery tests

稱樣量/g樣品量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%均值/%RSD/%2.001 20.048 40.023 70.072 2100.4299.21.32.000 80.048 40.023 70.071 898.732.005 40.048 50.023 70.071 597.052.002 30.048 50.048 20.097 1100.832.001 80.048 40.048 20.096 299.172.000 60.048 40.048 20.096 7100.212.000 50.048 40.071 90.120 199.722.005 70.048 50.071 90.118 897.771.999 70.048 40.071 90.119 298.47

3.2.6樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按照3.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照3.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2樣品的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Results of sample content determination

(n=2)

4 討論

4.1益母顆粒的質(zhì)量控制 益母顆粒中的當(dāng)歸、川芎藥材具有活血化瘀、行氣調(diào)經(jīng)止痛的功效，主治月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥，其質(zhì)量直接影響益母顆粒的療效，阿魏酸是當(dāng)歸、川芎中的主要有效成分，因此本實(shí)驗(yàn)采用測(cè)定阿魏酸的含量來控制當(dāng)歸和川芎的質(zhì)量[15-16]。

4.2當(dāng)歸與川芎TLC色譜展開劑的選擇 由于當(dāng)歸與川芎所含成分相似，因此本實(shí)驗(yàn)采用以當(dāng)歸對(duì)照藥材與川芎對(duì)照藥材同時(shí)作對(duì)照，對(duì)其進(jìn)行定性鑒別，比較了正己烷-乙酸乙酯(2∶1)，(4∶1)和(7∶1)3種比例的展開劑，結(jié)果顯示，乙酸乙酯比例越高，斑點(diǎn)展開越靠前，Rf值越大，實(shí)驗(yàn)證明采取4∶1比例分離效果好，Rf值適中，陰性無干擾，可用于當(dāng)歸與川芎的定性鑒別。

4.3流動(dòng)相配比及提取方法的選擇 HPLC法對(duì)阿魏酸進(jìn)行測(cè)定時(shí)，對(duì)流動(dòng)相配比進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)(13∶87)為流動(dòng)相，阿魏酸與雜質(zhì)峰的分離度較好，保留時(shí)間適宜。同時(shí)對(duì)提取方法進(jìn)行考察，結(jié)果以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑，超聲處理30 min提取效果佳，雜質(zhì)峰較少[17]。