衛(wèi)向鋒，霍 花，牛春玲，張 艷，鄭 倩，張 紅，孫婷婷，黨秋萍，劉建峰

(1.西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，西安 710032；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院北方醫(yī)院，沈陽 110034；3.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安 710031)

丹紅益腦膏是西安中醫(yī)腦病醫(yī)院院內(nèi)制劑，在臨床上使用已10多年，該處方由豬牙皂、丹參、紅花和冰片等7味藥材組成。紅花活血化瘀、通經(jīng)止痛[1]；豬牙皂可祛痰、開竅，為君藥[2]；丹參活血祛瘀止痛、清心除煩[3]；膽南星為辛涼之品，可熄風(fēng)定驚、清熱化痰[4];艾葉散寒止痛，取其外用溫熙氣血、透達(dá)經(jīng)絡(luò)，為臣藥[5]。石菖蒲醒神益智、開竅豁痰；冰片開竅醒神、通行十二經(jīng)，其中冰片又可引諸藥達(dá)腦竅，兼為方中使藥[6]。藥理研究證明，丹紅益腦膏能改善或恢復(fù)病理狀態(tài)下的血液黏度、促進(jìn)腦脊液循環(huán)，還能改善毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)腦脊液吸收；并能調(diào)節(jié)脈絡(luò)叢功能，抑制腦脊液分泌；減輕感染等引發(fā)的腦組織黏連[7-10]。為保證該制劑臨床使用有效、制劑質(zhì)量穩(wěn)定，采用TLC法對該制劑中丹參、冰片、豬牙皂和紅花進(jìn)行TLC鑒別，用HPLC法對豬牙皂中有效成分刺囊酸進(jìn)行含量測定，并在此基礎(chǔ)上制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 2010AT島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-100超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；BT25S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥 刺囊酸對照品(北京中科儀友化工技術(shù)研究院，批號141113)；齊墩果酸、冰片對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為0709-9803，111688-200501)；丹紅益腦膏(西安中醫(yī)腦病醫(yī)院制劑室，250 g·瓶-1)。

2 方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1冰片 精密稱取本品1 g，加甲醇20 mL，采用超聲法提取30 min，過濾，減壓濃縮至5 mL，即得供試品溶液。按照處方比例取不含冰片的陰性對照藥材，同法制成陰性樣品溶液。再精密稱取冰片對照品1 mg，加甲醇1 mL，溶解，作為對照品溶液。采用TLC法進(jìn)行鑒別，點樣量各5 μL，采用硅膠G薄層板；以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1∶2)為展開劑，展開后噴20 mL·L-1香草醛濃硫酸溶液，于105 ℃加熱2 min至斑點顯色清晰。在供試品色譜中，檢出冰片，缺冰片陰性樣品無干擾[11-12]。見圖1A。

圖1TLC圖

A:1.樣品(批號140901)；2.樣品(批號140902)；3.樣品(批號140903)；4.冰片對照品(批號111688-200501)；5.缺冰片陰性樣品。B:1.樣品(批號140901)；2.樣品(批號140902)；3.樣品(批號140903)；4.齊墩果酸對照品(批號0709-9803)；5.刺囊酸對照品(批號141113)；6.缺豬牙皂陰性樣品溶液.

Fig.1 TLC chromatograms

A:1.sample (batch number 140901)；2.sample (batch number 140902)；3.sample (batch number 140903)；4.borneol reference substance (batch number 111688-200501)；5.borneol negative samples.B:1.sample (batch number 140901)；2.sample (batch number 140902)；3.sample (batch number 140903)；4.oleanolic acid reference substance (batch number 0709-9803)；5.echinacanthic acid reference substance (batch number 141113)；6.missing gleditsia sinensis negative sample solution.

2.1.2豬牙皂 精密稱取本品1 g,與0.5 g硅藻土拌勻，再加入甲醇20 mL，采用超聲法提取30 min，濾過，濾液用水浴低溫蒸干，殘渣加水20 mL，移至圓底燒瓶中，加入濃鹽酸2 mL，100 ℃加熱回流30 min，取出，放冷至室溫，移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并2次提取液，低溫?fù)]去溶劑，加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。另按照處方比例稱取不含豬牙皂的陰性對照藥材，同法制成陰性樣品溶液。齊墩果酸對照品溶液：加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液。刺囊酸對照品溶液：加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。采用TLC法進(jìn)行鑒別，點樣量各5 μL，采用硅膠G薄層板，展開劑為三氯甲烷-甲酸-甲醇(20∶0.5∶0.5)，展開后噴100 mL·L-1硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱2 min至斑點顯色清晰。在供試品色譜中，檢出齊墩果酸和刺囊酸，缺豬牙皂陰性樣品無干擾[13]。見圖1B。

2.2樣品中刺囊酸的含量測定

2.2.1色譜條件 Diamonsil C18色譜柱；流動相：乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(72∶28)；檢測波長：215 nm；流速：1 mL·min-1；按照刺囊酸色譜峰計算理論塔板數(shù)大于3 000。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液：精密稱取刺囊酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.5 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

供試品溶液：取本品適量，精密稱取1.0 g，加入0.5 g硅藻土拌勻，再加入甲醇50 mL，超聲提取30 min，用提取溶劑補足減失的質(zhì)量，過濾，精密量取濾液30 mL，低溫水浴蒸干，加入200 mL·L-1鹽酸20 mL，100 ℃加熱水解30 min，取出，冷水冷卻，移至分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次30 mL，將乙醚液合并，低溫水浴蒸干，甲醇溶解，定容至10 mL，即得[14-16]。

陰性對照樣品溶液：取除豬牙皂以外的處方中其他藥材，按照上述方法制備陰性樣品，精密稱取適量陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性實驗 在2.2.1項色譜條件下對對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中刺囊酸峰分離度好，陰性樣品無干擾，故確定流動相比例為乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(72∶28)，見圖2。

2.2.4線性范圍考察 分別精密吸取質(zhì)量濃度為1.69 mg·mL-1的刺囊酸對照品溶液2，4，6，8和10 μL，測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=296 458.9x-140 543，r=0.999 9，刺囊酸在3.4～16.9 μg范圍內(nèi)，峰面積值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度實驗 精密吸取對照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測定其峰面積值，計算得RSD值為0.14%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實驗 取樣品適量，制備供試品溶液，分別放置0，2，4，6，8和12 h，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積及含量，結(jié)果表明，本樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD值為2.34%。

2.2.7重復(fù)性實驗 取樣品適量，制備供試品溶液5份，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定刺囊酸含量均值為11.46 mg·g-1，RSD值為1.97%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(11.46 mg·g-1)的樣品6份，置于具塞錐形瓶中，分別加入刺囊酸對照品6.10，6.10，7.88，7.88，9.42和9.42 mg，制備加樣回收供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算回收率，見表1。

圖2HPLC圖

A.刺囊酸對照品；B.供試品；C.缺豬牙皂陰性對照；1.刺囊酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.echinocystic acid reference substance；B.sample；C.Gleditsiasinensisnegative control；1.echinocystic acid.

表1刺囊酸回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Recovery test results of echogenic acid

(n=6)

實驗結(jié)果表明，刺囊酸回收率在95%～100%之間，平均回收率為97.98%，RSD值為0.68%，加樣回收率良好。

2.2.9樣品測定 分別精密稱取3批樣品適量，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，結(jié)果見表2。

表2樣品含量測定結(jié)果

Tab.2 Results of sample content measurement

批號樣品質(zhì)量/g刺囊酸含量/mg·g-1均值/mg·g-13批均值/mg·g-11409011.023 611.0311.1311.231.098 511.231409021.082 510.9511.611.006 312.271409031.091 210.3210.951.012 211.58

3 討論

腦積水的病機關(guān)鍵為瘀血阻絡(luò)、腦竅不通、水濕(液)停積，屬本虛標(biāo)實之證[17]。脾腎虧損為本，瘀血內(nèi)阻、水濕停積為標(biāo)，且本緩而標(biāo)急，故治療當(dāng)立足于活血通竅、化瘀通絡(luò)和消腫止痛[18-19]。臨床雖有不少治療的方藥制劑，但療效并不十分滿意，本制劑是西安中醫(yī)腦病醫(yī)院從水瘀理論出發(fā)論治，以提高臨床療效為目的，根據(jù)中醫(yī)辨證論治的理論和實踐經(jīng)臨床反復(fù)驗證總結(jié)出的中藥復(fù)方制劑。主治小兒腦積水91例，與傳統(tǒng)中醫(yī)辨證組37例進(jìn)行對照，具有良好的治療效果，顯效率達(dá)82%，總有效率達(dá)96.7%。未發(fā)現(xiàn)對肝、腎功能及造血系統(tǒng)的影響，表明該藥品使用安全。但由于中藥復(fù)方制劑質(zhì)量受采收季節(jié)、藥材產(chǎn)地等因素影響較大，因此為保證藥品臨床療效和質(zhì)量的穩(wěn)定性，我們采用TLC、HPLC等方法研究制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對該方中冰片、豬牙皂、紅花和丹參依次進(jìn)行了定性鑒別，結(jié)果顯示，冰片和豬牙皂的主斑點清晰可見，陰性對照無干擾，定性鑒別方法專屬性強。而紅花和丹參與樣品色譜相應(yīng)的位置上陰性均有干擾，因此，該方中紅花和丹參的TLC鑒別方法不能收入標(biāo)準(zhǔn)。

豬牙皂在本方配伍中為君藥，刺囊酸為豬牙皂中主要有效成分[20]，因此采用HPLC法建立刺囊酸的含量測定方法，結(jié)果顯示，刺囊酸能與樣品中其他成分分離良好且保留時間合適，陰性對照無干擾，在刺囊酸供試品制備過程中對乙醚萃取次數(shù)進(jìn)行了考察，實驗結(jié)果表明，乙醚萃取4次刺囊酸基本可提取完全，因此確定萃取次數(shù)為4次。本研究過程中對色譜條件進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)條件(321 nm、1 mL·min-1、25 ℃)樣品峰相比，流速和柱溫對測定結(jié)果影響較大，建議嚴(yán)格控制流速；檢測波長在319～323 nm范圍內(nèi)對測定結(jié)果無較大影響。綜上所述，本研究所建立的方法能作為丹紅益腦膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。