陳玎玎 黃淑芳 王才益 應(yīng)志豪 龔利洋 汪麗芬

(杭州動物園，杭州，310008)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種可以感染包括鳥類、人類及獸類在內(nèi)的幾乎所有溫血性動物的機會致病原蟲，呈世界性流行[1-2]。人或動物誤食被弓形蟲卵囊、弓形蟲包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形蟲[3-4]。弓形蟲對人和動物危害嚴重，可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎、先天性畸形，也會造成免疫力低下[5]。研究發(fā)現(xiàn)，重度的弓形蟲感染可導(dǎo)致澳大利亞有袋目(Marsupialia)、新世界猴(Platyrrhini)、狐猴(Lemuridae)、兔猻(Otocolobusmanul)、金絲雀(Serinuscanaria)類等野生動物死亡[2，5-6]。野生動物弓形蟲慢性感染時一般無明顯癥狀，這不僅給患病動物的診斷帶來極大的困難，而且對公共安全存在潛在的威脅，因此，對野生動物弓形蟲感染情況的調(diào)查顯得尤其重要。

國內(nèi)動物園總量約200家，然而在野生動物感染弓形蟲方面的調(diào)查相對較少，國內(nèi)現(xiàn)報道的僅有北京、成都、福州、上海，感染率在1.9%～47.46%[7-13]之間，成都大熊貓繁育基地、黑龍江東北虎林園、廣東等地也有零星發(fā)現(xiàn)[14-16]。另外，青海、新疆、北京等地分別對部分高原動物、嚙齒動物及鳥類進行調(diào)查，感染率分別為10.61%，0.52%(1/192)及27.48%[17-19]。杭州動物園首次對園內(nèi)野生動物進行弓形蟲血清學(xué)和分子生物學(xué)調(diào)查，以期為野生動物弓形蟲病的診斷和治療提供指導(dǎo)，同時為同行業(yè)提供指導(dǎo)和借鑒。

1 材料與試劑

1.1 野生動物血清及全血樣本

在2015～2017年期間共采集杭州動物園35種野生動物血清118份，其中哺乳綱食草動物50份、食肉動物43份、靈長類動物6份、禽類動物19份，無菌采集血液分離出血清。采集到全血13份，其中哺乳綱食草動物8份，食肉動物1份，靈長類3份，同樣-20℃冰箱保存。

1.2 實驗試劑設(shè)備

1.2.1 試劑

ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species試劑盒購自IDvet innovative Diagnostics，TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司。

1.2.2 設(shè)備

酶標儀購自Molecular Devices公司、Eppendorf排槍、Eppendorf移液槍、恒溫箱等。

2 弓形蟲抗體檢測方法

2.1 采用間接酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)法原理

微量板已經(jīng)用弓形體P30抗原包被，加入樣本和對照后，經(jīng)過孵育，若樣本中含有抗體，就會形成“抗原-抗體”復(fù)合物。通過第1次洗板后，再加入過氧化物酶結(jié)合物，含抗體樣本孔內(nèi)將形成“抗原-抗體-酶”的復(fù)合物。經(jīng)過第2次洗板，加入含底物TMB液。若存在抗體，溶液將呈現(xiàn)藍色，并在加入終止液后轉(zhuǎn)為黃色；若無抗體存在將不呈現(xiàn)任何顯色反應(yīng)，呈色反應(yīng)與樣本中抗體含量成正比。在450 nm波長檢測OD值，計算每個樣本S/P的百分比，即S/P%=(OD樣本-OD陰性對照)/(OD陽性對照-OD陰性對照)。當S/P%≤40%時為陰性，當40%

2.2 檢測步驟

樣本準備：保證不同樣品孵育時間一致，用一個空白96孔板對樣本和對照樣本用樣品稀釋液2進行1∶10的稀釋。

洗滌液準備：用蒸餾水按照1∶20的比例稀釋濃縮洗液，每個樣本進行2次洗板需要洗滌液600 μL，根據(jù)樣本的數(shù)量計算配制的量。

酶結(jié)合物準備：用樣品稀釋液3按1∶10的比例稀釋。

檢測：根據(jù)樣本量取出包被好的微量孔的個數(shù)，對照孔均設(shè)2個，每孔加稀釋過的樣本液體100 μL，在21 ℃(±5℃)下孵育(45±4)min后，進行洗板，要洗3次，最后一次在甩掉洗滌液后要吸去剩下的液體。以較快的速度加入稀釋好的酶結(jié)合物液體100 μL，最好采用連續(xù)加液器或排槍，在21 ℃(±5℃)下再孵育(30±3)min后，進行第2次洗板，同上洗3次。最后每孔加入100 μL底物，孵育(15±2)min后每孔加入100 μL終止液，然后在酶標儀的450 nm波長讀取OD值。

3 弓形蟲分子生物學(xué)鑒定方法

3.1 DNA的提取

使用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因組DNA提取試劑盒對全血樣本進行DNA提取。

3.2 PCR擴增

參照袁恒青等[20]的方法，進行PCR擴增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

4 結(jié)果及分析

4.1 弓形蟲抗體檢測結(jié)果

118份血清弓形蟲抗體IgG檢測結(jié)果為，總體陽性率21.19%(25/118)，其中食草性動物陽性率32.0%(16/50)，食肉性動物陽性率18.60%(8/43)，靈長類動物陽性率16.67%(1/6)，禽類動物未檢測到陽性抗體(0/19)。通過SPSS軟件采用卡方檢驗分析4類動物樣本數(shù)與陽性樣本數(shù)差異性，食草性動物與禽類動物弓形蟲抗體IgG差異極顯著(x2=7.650，P<0.01)，食肉性動物與禽類動物形蟲抗體IgG差異顯著(x2=3.089，P<0.05)。具體情況見表1。

表1 35種野生動物弓形蟲血清學(xué)抗體IgG檢測結(jié)果

續(xù)表1

注：表格中“/”表示S/P<50%(陰性)

Note：The“/”meansS/P<50% in the table

4.2 弓形蟲抗原分子生物學(xué)檢測結(jié)果

對從全血樣本中提取的DNA進行PCR擴增，19號樣本(金錢豹)電泳成像結(jié)果為弱陽性，其余樣本均為陰性(圖1)。

圖1 PCR擴增電泳結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplication 注：M為2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，泳道1為陽性對照，2為陰性對照，7～11，13～14，17～22為待測樣本，分別為黑猩猩、黇鹿、斑馬、梅花鹿、黇鹿、梅花鹿、黇鹿、黑猩猩、斑馬、金錢豹、黑猩猩、黇鹿、黇鹿，其余編號樣本與本次調(diào)查無關(guān) Note：M：2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)；1：Positive control；2：Negative control；7-11，13-14，17-11：chimpanzee，fallow deer，zebra，sika deer，fallow deer，sika deer，fallow deer，chimpanzee，zebra，leopard，chimpanzee，fallow deer，fallow deer，respectively.Other samples have nothing to do with this survey

5 討論

弓形蟲IgG抗體一般在感染后1～2周出現(xiàn)陽性，3～5周抗體效價達到高峰，并可維持多年。目前，弓形蟲血清型檢測的方法主要有改進凝集檢測法(MAT)、間接紅細胞凝集檢測法(IHAT)和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測法(ELISA)等[21]。張述義等[12]用ELISA、MAT和IHAT 3種方法檢測動物與人血清的弓形蟲抗體，結(jié)果顯示：這3種檢測方法對其弓形蟲陽性檢出率無顯著差異，都可用于弓形蟲血清流行病學(xué)調(diào)查。本試驗采用ELISA法檢測野生動物血清抗體。

杭州動物園118份野生動物檢測結(jié)果總體陽性率為21.19%，與國內(nèi)成都、上海和福州動物園等[7-8，10-11]和國外部分動物園[3，6，22-23]弓形蟲檢測相比，感染率略低。其中，食草動物感染率顯著高于其他幾類動物，羊駝尤甚，這可能與場館設(shè)計以及園內(nèi)存在的流浪貓有關(guān)。以羊駝為例，羊駝的外場為開放式的生態(tài)化展示結(jié)構(gòu)，沒有籠網(wǎng)等物理隔離提高了動物的展示效果，但也導(dǎo)致了流浪貓可以自由進出籠舍。杭州動物園曾對區(qū)域內(nèi)流浪貓的血清樣本進行過檢測，發(fā)現(xiàn)其弓形蟲抗體IgG陽性率約為50%，陽性率高。貓科(Felidae)動物為弓形蟲重要的終宿主，弓形蟲卵囊會隨貓科動物的糞便在環(huán)境中傳播[2]。流浪貓弓形蟲的感染率處于較高水平，在弓形蟲的傳播過程中發(fā)揮著重要作用[13，24]，羊駝很有可能因采食到被弓形蟲卵囊污染的食物而感染。以上情況都提示我們應(yīng)嚴格控制流浪貓數(shù)量，并加強對動物籠舍的消毒管理，切斷傳播途徑。

對于禽類弓形蟲的檢測，多篇文獻檢測結(jié)果間存在差異。Tidy等[3]對葡萄牙的兩所動物園的檢測顯示22.1%禽類弓形蟲檢測為陽性，Lopes等[4]對葡萄牙部分區(qū)域的野生動物進行弓形蟲檢測顯示50%的禽類弓形蟲檢測為陽性；Minervino等[6]對巴西部分區(qū)域的野生動物弓形蟲的檢測結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果；胡春梅等[19]對北京地區(qū)131只野生鳥類的弓形蟲血清學(xué)檢測陽性率為27.48%。周忠勇等[25]曾對上海動物園內(nèi)20種36份鳥類血清進行檢測，陽性率11.11%。Huang等[26]使用PCR對國內(nèi)不同地區(qū)178只野生鳥類肌肉樣本檢測，陽性率2.24%(4/178)。對于本實驗中樣本未檢測出抗體陽性結(jié)果，可能與本次采集禽類樣本量有限(僅以藍孔雀、蓑羽鶴及小天鵝為主)有關(guān)，也有杭州動物園禽類弓形蟲感染率較低的可能，其深層次原因有待進一步調(diào)查。

PCR檢測僅有1個陽性的結(jié)果，該個體抗體檢測也為陽性，確認其處于感染期。其余抗體檢測陽性，分子生物學(xué)檢測陰性顯示動物可能曾經(jīng)受到過感染。對于本次檢測中確診處于弓形蟲病感染期的金錢豹個體，雖然其并未進入繁殖梯隊，但作為弓形蟲感染的終末宿主，為保障動物福利、目前已針對性用藥。另外，因弓形蟲病經(jīng)治療后個體極易成為帶蟲者，在日常飼養(yǎng)管理中，要嚴格注意清潔消毒，預(yù)防交叉感染和重復(fù)感染。有報道未經(jīng)加工的生肉是造成弓形蟲在人群中傳播的主要原因[27]，再次提示我們要做好消毒工作。