吳斌　張眉 姜珊珊 張安盛 崔漢青 辛志梅 馬立平 王升吉

摘要：2015—2017年對(duì)采自山東、河南、遼寧、黑龍江及陜西等省份的具有TuMV癥狀的大白菜、蘿卜樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序獲得了214個(gè)TuMV CP序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示3個(gè)特點(diǎn)：各地大白菜、蘿卜TuMV CP序列分離物大致歸屬于world-B和basal-BR 2個(gè)組；TuMV分離物歸屬既有寄主關(guān)聯(lián)性，又有地域性；同一地點(diǎn)的物種內(nèi)TuMV分離物表現(xiàn)較好的一致性，但也存在多樣性。研究結(jié)果為十字花科蔬菜抗TuMV育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大白菜；蘿卜；蕪菁花葉病毒；系統(tǒng)進(jìn)化；序列分析

中圖分類號(hào)：S436.341.1+1+S436.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）08-0100-06

Phylogenetic Evolution and CP Nucleotide Sequence Analysis of

TuMV in Chinese Cabbage and Radish

Wu Bin1， Zhang Mei1， Jiang Shanshan1， Zhang Ansheng1，

Cui Hanqing2， Xin Zhimei1， Ma Liping2， Wang Shengji1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of Plant Virology，

Jinan 250100， China；2. Vocational Secondary Professional School of Pingdu City， Pingdu 266752， China）

Abstract Chinese cabbage and radish samples with TuMV symptoms were collected from Shandong， Henan， Liaoning， Heilongjiang and Shaanxi Province in 2015-2017， and 214 CP sequences of TuMV （Turnip mosaic virus） were obtained by detection. Phylogenetic analysis showed three characteristics. The first， TuMV CP sequences of all isolates were assigned to two groups that were world-B and basal-BR. The second， the ascription of TuMV isolates had not only host association but also regional correlation. The last， TuMV isolates of the same place showed good consistency and a certain extent of diversity. The research provided theory evidences for breeding of cruciferous vegetables to resist TuMV.

Keywords Chinese cabbage； Radish； Turnip mosaic virus； Phylogenetic evolution； Sequence analysis

蕪菁花葉病毒（TuMV）是馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）重要成員[1，2]，是僅有的侵染蕓薹屬（Brassica）植物的Potyvirus屬病毒?？汕秩敬蟀撞恕⑻}卜等十字花科蔬菜作物在內(nèi)至少43科156屬300多種植物[3，4]，是蔬菜上僅次于黃瓜花葉病毒的第二大病毒[5，6]，可對(duì)蔬菜生產(chǎn)造成巨大損失。

傳統(tǒng)的株系（種群）劃分主要依賴于對(duì)鑒定寄主的侵染能力和癥狀反應(yīng)，但這類劃分方法由于使用不同的鑒別寄主譜而表現(xiàn)出一定的局限性。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)方法已大量應(yīng)用于TuMV種群遺傳變異進(jìn)化研究中，其中3′-UTR、CP及P1等基因均被用來(lái)進(jìn)行株系劃分[7-9]。Ohshima等[10]和Tomimura等[11]用生物學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，將來(lái)自世界各地的TuMV分離物劃分為2組寄主致病型：一種是BR寄主型，系統(tǒng)侵染蕓薹屬和蘿卜屬（Raphanus）植物；另一種是B寄主型，只系統(tǒng)侵染Brassica植物，而幾乎不侵染Raphanus植物。在系統(tǒng)關(guān)系中，這些分離物被進(jìn)一步分為basal-B、basal-BR、Asian-BR和world-B組，而basal-B組中沒(méi)有中國(guó)分離物。Tian等[12]將中國(guó)的TuMV分離物分為3個(gè)組：Asian-BR、world-B和basal-BR組。本研究利用分子生物學(xué)手段，將采自山東、河南、遼寧、黑龍江及陜西等省份的大白菜、蘿卜疑似TuMV樣品進(jìn)行了CP基因測(cè)序，研究其群體遺傳變異、株系變異與進(jìn)化，確定歸屬地位，以期為十字花科蔬菜抗TuMV育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015—2017年，分別于每年9—11月份于山東省濟(jì)南、青島、煙臺(tái)、棗莊、濰坊及河南省鞏義、原陽(yáng)、遼寧省沈陽(yáng)、黑龍江省哈爾濱、陜西省西安等地采集表現(xiàn)花葉、皺縮、植株矮化、畸形等癥狀的大白菜、蘿卜葉片樣品，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采樣時(shí)，每個(gè)采樣點(diǎn)分別采集5～6個(gè)大白菜、蘿卜樣品，3年累計(jì)采集大白菜樣品243個(gè)，蘿卜樣品296個(gè)。每個(gè)檢出病毒序列命名按采樣時(shí)省、市（或縣級(jí)市，個(gè)別鎮(zhèn)）拼音縮寫(xiě)（大寫(xiě)）后加采集蔬菜種類英文縮寫(xiě)前1～3個(gè)小寫(xiě)字母（白菜c，蘿卜rad）、采樣序號(hào)，最后為年份。

RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Easy Taq（5 U/μL）、10 × Easy Taq Buffer、dNTPs（含Mg2+，2.5 mmol/L）、凝膠回收試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000 Plus，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其它常規(guī)化學(xué)藥劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器

Centrifuge 5430R小型高速冷凍式離心機(jī)、Mastercycler nexus PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；JY 300電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；AE224C電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 TuMV CP基因 RT-PCR擴(kuò)增 RT-PCR的引物根據(jù)GenBank中報(bào)道的TuMV的CP基因序列，并參照莊木等[13]的報(bào)道設(shè)計(jì)合成。TuMV CP-F：5′-CAAGCAATCTTTGAGGATTAT G-3′；TuMV CP-R：5′-TATTTCCGATAAGCGAGAATA-3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。按照RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；94℃ 20 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 TuMV CP基因測(cè)序 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，提交測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析和序列比對(duì)分析 借助DNAstar和BLAST軟件對(duì)獲得的各分離物CP序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并選取NCBI上已發(fā)表的有代表性分離物CP基因序列做參照，用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)Bootstrap 1 000重復(fù)進(jìn)行各分支置信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TuMV的田間癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，秋季大白菜、蘿卜等十字花科蔬菜上TuMV發(fā)生普遍，顯癥率一般在35%～65%，嚴(yán)重的達(dá)70%以上。主要表現(xiàn)為葉片皺縮、畸形、花葉、黃化、皰狀突起、脈間失綠、蕨葉、植株矮化等（圖1）。

2.2 各地樣品TuMV CP基因RT-PCR擴(kuò)增

對(duì)采集的樣品進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性樣品均可擴(kuò)增出986 bp的預(yù)期片段且無(wú)其它非特異性條帶（圖2），大白菜和蘿卜樣品陽(yáng)性檢出率分別為67.6%和83.2%。

2.3 各地TuMV CP序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)RT-PCR和測(cè)序分析共獲得214個(gè)TuMV CP序列。分別對(duì)獲得的大白菜、蘿卜部分分離物TuMV CP序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，用分屬于該病毒不同組的9個(gè)NCBI下載序列做參照，并以同屬馬鈴薯Y病毒屬成員的水仙黃條病毒（NYSV，AJ311372）為樹(shù)根（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示以下3個(gè)特點(diǎn)：各地大白菜、蘿卜TuMV CP序列分離物均屬于world-B和basal-BR組，而無(wú)Asian-BR和basal-B組的分離物；TuMV分離物歸屬首先是由侵染寄主決定的，其次是受地理位置的影響，即TuMV分離物歸屬既有寄主關(guān)聯(lián)性，又有地域性，寄主關(guān)聯(lián)性表現(xiàn)在大白菜TuMV CP分離物80%聚集于world-B組（圖3A），而蘿卜TuMV CP分離物93.67%聚集于basal-BR組（圖3B），TuMV的歸屬地域性表現(xiàn)在同一地點(diǎn)的大白菜間、蘿卜間樣品分離物在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中集中成簇的現(xiàn)象較多；同一地點(diǎn)的大白菜間、蘿卜間TuMV分離物間既有一致性，但也存在多樣性。

2.4 各地TuMV CP基因核苷酸同源性分析

選擇13個(gè)采自代表性產(chǎn)區(qū)的TuMV分離物CP序列及分屬于該病毒不同組的6個(gè)NCBI下載序列，同屬于馬鈴薯Y病毒屬的水仙黃條病毒（NYSV，AJ311372）做參照，利用Megalign軟件對(duì)CP基因的核苷酸同源性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，所選TuMv CP核苷酸序列同源性為88.3%～99.8%。屬于致病型basal-BR組的7個(gè)分離物之間和屬于world-B組的6個(gè)分離物之間的同源性較高，如basal-BR組內(nèi)分離物間同源性為94.6%～99.8%，world-B組內(nèi)分離物為95.3%～99.3%；而basal-BR與world-B致病型組間核苷酸同源性較低，為88.3%～91.6%。

3 討論與結(jié)論

分子變異是植物病毒種群（株系）遺傳變異并致使其生物學(xué)性狀及致病性變化的內(nèi)在原因，植物病毒分子變異在基因組全序列上反映最為清楚，但由于全基因組測(cè)序需要花費(fèi)大量的時(shí)間和資金，因而通常對(duì)病原的分子變異不是選擇整個(gè)基因組而是選擇其中的某個(gè)基因進(jìn)行研究[14]。在Potyvirus屬病毒基因組中，CP和HC-Pro基因序列差異能充分反映病毒種類及株系間的分子變異[15]。因此本研究選擇CP基因作為T(mén)uMV種群變異的研究對(duì)象。

本研究對(duì)3年來(lái)采集自山東等五省市的大白菜、蘿卜的TuMV分離物CP基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明TuMV株系間存在廣泛的遺傳多樣性，尤其是不同寄主種類的TuMV分離物之間，且不同分離物之間存在重組現(xiàn)象（將另文報(bào)道）。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，所獲得的TuMV分離物均分屬于basal-BR組和world-B組，缺少basal-B組和Asian-BR組分離物。據(jù)報(bào)道，basal-B組的分離物一般來(lái)自于歐亞大陸的西南和中部的蕓薹或蕓薹屬植物，本研究獲得的分離物缺少basal-B組的成員，這與前人[12，16-18]的研究結(jié)果一致。中國(guó)TuMV分離物缺乏basal-B組，是地理位置的隔離還是寄主選擇性的結(jié)果，值得進(jìn)一步探討。Asian-BR大多來(lái)源于東亞，特別是日本，寄主大多是蘿卜，本研究的214個(gè)大白菜、蘿卜分離物TuMV CP序列也缺少Asian-BR組的成員，這與李玲玲[16]、祝富祥等[18]的報(bào)道一致，但與張成玲[19]的研究結(jié)果不一致，這種差異可能是不同年份TuMV不同株系流行傳播分別承受著不同的選擇壓力造成的。Asian-BR組分離物在我國(guó)不占優(yōu)勢(shì)，可能因?yàn)樵谖覈?guó)多數(shù)地區(qū)的流行經(jīng)受中性或負(fù)向選擇，在傳播中處于收縮狀態(tài)或平衡狀態(tài)，所以會(huì)隨不同年份出現(xiàn)此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象。

basal-BR組和world-B組分離物在我國(guó)各地普遍流行發(fā)生，且大多數(shù)大白菜分離物TuMV CP序列屬于world-B，大多數(shù)蘿卜分離物TuMV CP序列屬于basal-BR，表明各地TuMV分離物歸屬存在明顯的寄主關(guān)聯(lián)性，同時(shí)與地理位置也有關(guān)，表現(xiàn)在同一地點(diǎn)的大白菜分離物間、蘿卜分離物間有較好的一致性，同時(shí)也存在一定的多樣性，這與TuMV種群自然流行的遺傳變異、傳播主要由傳毒介體蚜蟲(chóng)完成有關(guān)。綜上所述，TuMV種群的遺傳變異是寄主適應(yīng)、基因重組和地理分布等多因素綜合作用的結(jié)果。

參 考 文 獻(xiàn)：

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