雷金麗，黃永梅，謝文熙，詹靜婷，張海濤，4，*，羅輝，3，*

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，廣東湛江524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)湛江市環(huán)北部灣海洋微生物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524023；3.廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江524023；4.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江524023）

多糖是一類由多個(gè)單糖結(jié)合形成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。多糖在自然界中分布廣泛，對生物體具有重要作用，是生物體維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一。多糖具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤[1]，抗菌[2]，抗氧化[3]和免疫調(diào)節(jié)[4]等。一些多糖衍生物如瓊膠，蘆薈膠，透明質(zhì)酸，卡拉膠等已經(jīng)被應(yīng)用到生產(chǎn)中。

紫球藻（porphyridium creuntum）是一類重要的海洋微藻，是紅藻門中唯一的單細(xì)胞類群。其生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，會向胞外分泌大量的多糖，多糖的含量可達(dá)生物量的50%。該糖主要由半乳糖，葡萄糖，木糖等單糖構(gòu)成。紫球藻多糖具有獨(dú)特的膠體性能，水溶液黏度大，與卡拉膠類似，在pH 1～12，溫度20℃～90℃范圍內(nèi)穩(wěn)定。紫球藻多糖的活性已經(jīng)取得多方面的研究進(jìn)展，例如抗氧化作用[5]；抗菌與抗病毒作用[6]；抗腫瘤[7]等。有關(guān)紫球藻多糖對體外免疫細(xì)胞免疫功能的研究較少，本文主要從細(xì)胞水平初步研究紫球藻多糖對免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為今后紫球藻多糖開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)劑提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種與細(xì)胞株

紫球藻：廣東恒興南方科技有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株RAW264.7（ATCC TIB-71）：上海細(xì)胞研究所。

1.1.2 試劑

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（商品名：噻唑藍(lán)）（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）粉末：美國sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Penicilin Streptomycin雙抗：美國Gibco公司；小鼠腫瘤壞死因子-α試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-6試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；一氧化氮檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；丙酮：天津化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、冰醋酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

240i CO2培養(yǎng)箱、1300series A2 超凈臺、30011031酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；596489熒光倒置顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 紫球藻多糖的制備

將收集的藻液離心，藻泥經(jīng)單蒸水洗滌后冷凍干燥成藻粉，取適量藻粉放入索氏提取器中脫脂，將脫油脂的藻粉按照1∶50（g/mL）放入單蒸水中，加復(fù)合蛋白酶75 mg，于50℃的恒溫磁力攪拌器中酶解4 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心20 min后，棄沉淀，上清液調(diào)pH值至7.0，透析，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮大約至原體積的1/3，向其中加入3倍體積的95%乙醇4℃冰箱過夜沉淀，沉淀后的溶液經(jīng)離心棄上清，沉淀用無水乙醇和丙酮依次洗滌2次后冷凍干燥，得干燥粗多糖。試驗(yàn)前將稱取8 mg的粗多糖，溶于10 mL的滅菌水中得到濃度為800 μg/mL的多糖溶液，用0.22 μm濾膜過濾備用，使用時(shí)再依次稀釋得到400、200、100、50、25、12.5 μg/mL 的溶液。

1.3.2 RAW264.7細(xì)胞活力的測定

收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，接種于96 孔板中，100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。設(shè)計(jì)空白組，紫球藻多糖組，LPS陽性對照組，每孔加入已經(jīng)稀釋好的不同濃度紫球藻多糖溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；將板取出，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，每孔加入 150 μL DMSO，低速震蕩10 min使結(jié)晶紫完全溶解，490 nm處的吸光值。

1.3.3 細(xì)胞上清液中NO含量測定

制備細(xì)胞濃度為1（106個(gè)/mL的巨噬細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板中，100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如1.3.2分組與加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，從每孔上清液吸取50 μL到新的96孔板中，用Griess法測定NO的含量。

1.3.4 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的檢測

制備細(xì)胞濃度為1（106個(gè)/mL的巨噬細(xì)胞懸液，接種于 96孔板中，100 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如1.3.2分組與加藥，培養(yǎng)24 h后，加入0.05%的中性紅100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 min，傾掉中性紅，用溫PBS洗3次，每孔加入細(xì)胞裂解液（無水乙醇：冰醋酸=1∶1（體積比）200 μL。4℃冰箱靜置 2 h～3 h，待細(xì)胞裂解后，540 nm處測定吸光值，并計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent，ELISA）試劑盒檢測細(xì)胞因子釋放情況

制備細(xì)胞濃度為1（106個(gè)/mL的巨噬細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板中，200 μL/孔，置 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如1.3.2分組與加藥，培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心10 min。取上清并按照小鼠TNF-α與IL-6試劑盒操作。用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，450 nm處測最大吸收波長，570 nm作為參考波長，最后的OD用最大波長OD值減去參考波長的OD值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差檢驗(yàn)法處理，方差齊時(shí)用LSD方法進(jìn)行組間的比較，方差不齊時(shí)，用Dunnett T3比較，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫球藻多糖對細(xì)胞活力的影響

紫球藻多糖對細(xì)胞活力的影響見圖1。

圖1 不同濃度紫球藻多糖對細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of porphyridium creuntum polysaccharide on cell viability

采用MTT法檢測細(xì)胞活力時(shí)，用細(xì)胞相對增殖率表示藥物對細(xì)胞活力的影響，樣品組的吸光值與空白組的吸光值之比的百分率即為細(xì)胞相對增殖率。當(dāng)細(xì)胞相對增殖率大于100%時(shí)，表明細(xì)胞增殖，活力上升，藥物對細(xì)胞無毒性；當(dāng)細(xì)胞相對增殖率小于100%時(shí)，細(xì)胞生長受到抑制，活力下降，藥物對細(xì)胞有抑制作用。如圖1所示，加藥培養(yǎng)24 h與48小時(shí)后，細(xì)胞相對增殖率幾乎都是100%，與空白對照組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明紫球藻多糖濃度在12.5 μg/mL～400 μg/mL范圍內(nèi)不影響細(xì)胞活力，對細(xì)胞無毒性。

2.2 紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞釋放NO的影響

紫球藻多糖刺激巨噬細(xì)胞釋放NO情況見圖2。

圖2 不同濃度紫球藻多糖刺激巨噬細(xì)胞釋放NO情況Fig.2 Effects of different concentrations of porphyridium creuntum polysaccharide on the release of NO of mirophage cell

從圖2可以看出，LPS和不同濃度的紫球藻多糖均能夠促進(jìn)細(xì)胞釋放NO，與空白組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NO的釋放量與紫球藻多糖濃度呈劑量依懶性。

2.3 紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響見圖3。

圖3 不同濃度紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.3 Effects of different concentrations of porphyridium creuntum polysaccharide on the phagocytosis of mirophage cell

與正常對照組相比，LPS與各濃度紫球藻多糖均能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅，紫球藻多糖在12.5 μg/mL～400 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 細(xì)胞因子TNF-α與IL-6的分泌情況

紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響見圖4。

圖4 不同濃度紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響Fig.4 Effects of different concentrations of porphyridium creuntum polysaccharide on the secretion of TNF-α of macrophages

由圖4可知，與空白組相比，不同濃度的紫球藻多糖和LPS均能夠促進(jìn)TNF-α的分泌，有顯著性差異（P＜0.05）。TNF-α的分泌呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，質(zhì)量濃度從 12.5 μg/mL～50 μg/mL時(shí)，分泌量上升，100 μg/mL～400 μg/mL 范圍內(nèi)，分泌量下降。50 μg/mL的濃度促進(jìn)作用最強(qiáng)。

紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞分泌IL-6的影響見圖5。

圖5 不同濃度紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞分泌IL-6的影響Fig.5 Effects of different concentrations of porphyridium creuntum polysaccharide on the secretion of IL-6 of macrophages

不同濃度的紫球藻多糖和LPS均能夠促進(jìn)IL-6的分泌，但是IL-6的分泌量隨著紫球藻多糖濃度的增加出現(xiàn)降低的趨勢，但是仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在12.5 μg/mL時(shí)促進(jìn)效果最佳。

3 討論與總結(jié)

巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，是一種重要的免疫細(xì)胞，參與非特異性防御與特異性防御過程。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，吞噬能力是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的通路之一。巨噬細(xì)胞通過其表面的受體識別入侵的病原微生物等抗原性異物，將異物進(jìn)行吞噬或者胞飲作用傳遞到細(xì)胞內(nèi)，成為吞噬體，在吞噬體內(nèi)通過自身的滅菌系統(tǒng)將異物清除，同時(shí)巨噬細(xì)胞還可以作為提呈細(xì)胞，將吞噬的異物提呈給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。另一方面一些細(xì)胞因子如TNF-α，IL-6等與活性效應(yīng)分子如NO的釋放均可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞識別抗原性異物，提高巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。

細(xì)菌感染主要是由革蘭陰性菌引起的，LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，它對宿主有毒性作用，可引起發(fā)熱，內(nèi)毒素休克等。LPS特異性的與細(xì)胞表面的TLR-4受體結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、NO等細(xì)胞因子來抵抗外來入侵，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，多糖調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，表現(xiàn)為增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬能力，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、NO等。如Song等[8]發(fā)現(xiàn)柴胡多糖通過促進(jìn)NO和細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生來提高機(jī)體的免疫力。liu等[9]建立了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫低下模型，給予黃芪多糖治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且能使免疫低下組小鼠的TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子恢復(fù)到正常水平。Jose等[10]研究了硫酸化扇藻多糖對RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明扇藻硫酸多糖通過促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，增加NO的釋放，提高TNF-α，IL-6等細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。ren等[11]探究了羥乙基化猴頭菌多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用，試驗(yàn)表明，羥乙基化猴頭菌多糖通過刺激TNF-α、IL-6、NO的分泌來提高免疫活性。

NO是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子[12]，各種外界的刺激，如LPS等均可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO。NO對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)十分廣泛且復(fù)雜，是巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)，且參與殺害病原微生物，殺害腫瘤細(xì)胞，并介導(dǎo)一系列的免疫應(yīng)答過程。

TNF-α是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)。TNF-α也是一種關(guān)鍵的炎癥因子，在宿主防御過程中起著重要作用。IL-6可以誘導(dǎo)成熟的CD4+T分化為Th2細(xì)胞并促進(jìn)B細(xì)胞對免疫球蛋白和急性期球蛋白的分泌。

本試驗(yàn)基于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7，初步探究了紫球藻多糖對其存活率，吞噬能力，NO釋放能力以及細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌能力的影響。由于LPS能夠很好的激活巨噬細(xì)胞，是探究巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用常用的陽性對照藥物，因此本試驗(yàn)選擇LPS作為陽性對照，通過免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)的指標(biāo)，共同探究其與紫球藻多糖對巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用規(guī)律。結(jié)果表明：紫球藻多糖作用24 h時(shí)，與空白對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對細(xì)胞存活力無影響，但是作用48小時(shí)后，細(xì)胞存活率相對于空白組雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是細(xì)胞活力相比于24 h稍微有點(diǎn)降低，說明藥物作用24 h時(shí)效果較好。因此為了排除藥物本身對試驗(yàn)的干擾，本文所采取藥物作用時(shí)間為24 h。在本試驗(yàn)中，不同濃度的紫球藻多糖與LPS均可以刺激細(xì)胞釋放NO，紫球藻多糖組的NO釋放量均低于LPS組，但紫球藻多糖組與LPS組的釋放量均高于空白組，且相對于空白組都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；這與Zheng Pimiao等[13]研究的結(jié)果一致。說明紫球藻多糖能夠激活巨噬細(xì)胞。Zheng Yi等[14]研究川芎多糖對免疫抑制小鼠功能改善作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)川芎多糖可以提高免疫抑制小鼠吞噬細(xì)胞的活性，川芎多糖濃度越大，吞噬能力越強(qiáng)，呈劑量依賴性。類似的，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的紫球藻多糖都能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，且吞噬能力隨著紫球藻多糖濃度的增加而增強(qiáng)，相比于空白組都具有顯著性差異（P＜0.05）。在12.5 μg/mL～50 μg/mL 濃度范圍，吞噬能力增強(qiáng)的比較明顯，但是小于LPS的增強(qiáng)作用；濃度在100 μg/mL～400 μg/mL時(shí)，雖然吞噬能力隨著紫球藻多糖濃度增大而增強(qiáng)，且高于LPS的刺激，但是增強(qiáng)能力趨于平緩。說明低濃度范圍的紫球藻多糖能較好的增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，而這一點(diǎn)與Zheng Yi的報(bào)道有所區(qū)別。有研究表明多糖受體主要是Ш型補(bǔ)體受體，屬于整合素家族，主要存在于巨噬細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和多形核中性粒細(xì)胞表面。多糖與受體結(jié)合有一下幾個(gè)特點(diǎn)：可逆性、飽和性，特異性且存在活性中心?；诖?，紫球藻多糖與巨噬細(xì)胞的作用可能作用存在一個(gè)飽和值，這個(gè)飽和值可能與細(xì)胞膜表面受體有關(guān)，所以導(dǎo)致濃度升高，巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)的效果不明顯。因此有關(guān)紫球藻多糖與巨噬細(xì)胞表面受體的相互作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。不同濃度的紫球藻多糖均可以刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，與空白對照組相比，都具有顯著性差異（P＜0.05）。但是TNF-α釋放量呈先上升后下降的趨勢，最佳釋放量對應(yīng)的紫球藻多糖濃度是50 μg/mL。各濃度的紫球藻多糖同樣可以刺激IL-6的釋放，但是IL-6的釋放量隨著紫球藻濃度的增加反而出現(xiàn)降低的趨勢，但是相比于空白對照組，仍具有顯著性差異（P＜0.05）。紫球藻多糖濃度在12.5 μg/mL～100 μg/mL 區(qū)間內(nèi)，對 IL-6 釋放量的促進(jìn)作用比較明顯，且各組間的釋放量相差不大，而濃度在 200 μg/mL～400 μg/mL 區(qū)間促進(jìn)作用明顯低于12.5 μg/mL～100μg/mL該區(qū)間的促進(jìn)作用。因此綜上紫球藻多糖濃度為50 μg/mL時(shí)，是促進(jìn)TNF-α與IL-6釋放的最佳濃度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Liu Wei等[15]，Liu Xin等[16]，多糖通過刺激TNF-α與IL-6分泌來提高免疫水平，且隨著多糖濃度的升高，TNF-α與IL-6的分泌量上升。然而本研究結(jié)果并未與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致，這可能與紫球藻多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其與細(xì)胞表面受體作用特點(diǎn)，其巨大的分子量有關(guān)，因此紫球藻多糖劑量與TNF-α與IL-6的分泌量的關(guān)系仍需要更進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)首次探究紫球藻多糖對兩種重要細(xì)胞因子TNF-α與IL-6分泌的影響，并且取得了良好效果。綜上，本研究初步證明，紫球藻多糖通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)NO、TNF-α與IL-6的釋放來參與免疫應(yīng)答，提高機(jī)體的免疫力。