趙展慶,張萬科,符妹垂，周小敏,余秉昌，林奇棟

(1海南西部中心醫(yī)院，海南儋州 571799；2海南醫(yī)學(xué)院)

哮喘發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，已成為一個(gè)嚴(yán)重的世界性社會(huì)公共衛(wèi)生問題[1]。基于對(duì)氣道炎癥是哮喘的本質(zhì)這一認(rèn)識(shí)，傳統(tǒng)抗炎藥物糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為是目前最有效的哮喘治療藥物。然而，糖皮質(zhì)激素治療過程中的諸多毒副作用不同程度地影響其在臨床中的應(yīng)用。屈頭雞是生長(zhǎng)在海南少數(shù)民族山區(qū)的一種植物?，F(xiàn)有的資料認(rèn)為，屈頭雞果具有治療咳嗽、哮喘的功效[2]，但尚無相關(guān)的觀察和研究證實(shí)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，Th1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如IL-2、IL-10、IFN-γ，可減輕哮喘的氣道炎癥，抑制哮喘發(fā)作；而Th2細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等，則可加重哮喘的氣道炎癥，引發(fā)哮喘。2017年1～12月，本課題以屈頭雞果果漿灌胃干預(yù)哮喘小鼠，觀察在治療劑量和中毒劑量下，哮喘氣道炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ以及IL-4、IL-5的變化，以明確其是否有抑制氣道炎癥的作用，并探討其可能的機(jī)制，為今后屈頭雞果在哮喘中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器與試劑 雌性SPF級(jí)BALB/c純系小白鼠50只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量16～20 g，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有小鼠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。屈頭雞果(海南本地產(chǎn)植物)；卵蛋白(美國(guó)SigmaⅤ級(jí)，純度>98%)；氫氧化鋁凝膠(廣州化學(xué)試劑廠)；地塞米松注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司)；IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒(上海川翔科技有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安奇科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Genecore公司)。

1.2 小鼠哮喘模型制備及屈頭雞果用法 將50只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、哮喘模型組(B組)、屈頭雞果治療劑量組(C組)、屈頭雞果中毒劑量組(D組)、地塞米松治療組(E組)5組，每組10只。A組第0、14天腹腔注射0.2 mL生理鹽水，第24天以生理鹽水10 mL霧化，每天30 min，連續(xù)28天。B組第0、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含卵白蛋白100 μg、氫氧化鋁凝膠400 μg)，第24天以1%卵蛋白溶液10 mL霧化激發(fā)哮喘，每天30 min，連續(xù)28天。C組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min灌胃屈頭雞果果漿2.16 g/kg[2]。D組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min灌胃屈頭雞果果漿10.8 g/kg[3]。E組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min腹腔注射地塞米松2 mg/kg。

1.3 小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型細(xì)胞因子水平檢測(cè) 在末次激發(fā)結(jié)束后30 min，所有小鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，放血處死。開胸，剪開頸部皮膚暴露氣管，用頭皮針在頸部行氣管插管并以絲線結(jié)扎固定；結(jié)扎右肺，經(jīng)氣管套管向左肺緩慢注入生理鹽水0.5 mL，邊按摩胸部邊回收液體，反復(fù)抽吸3次，回收率80%以上。將取得的肺泡灌洗液取20 μL用以細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余放入離心管中，10 000 r/min，離心后留取上清液分裝于Eppendoff管，進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平的ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果

末次激發(fā)結(jié)束時(shí)A組、B組、C組及E組小鼠均存活，D組小鼠在給藥的過程中先后死亡4只，存活的6只也存在不同程度嘔吐、腹瀉、心律加快和抽搐等癥狀。各組小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型細(xì)胞因子水平比較見表1、2。

表1 各組小鼠肺泡灌洗液Th1型細(xì)胞因子

注：與A組比較，★P<0.01；與B組比較，△P<0.05；與E組比較，#P<0.05，*P<0.01。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液Th2型細(xì)胞因子水平

注：與A組比較，★P<0.01；與B組比較，△P<0.05，與E組比較，#P<0.05。

3 討論

當(dāng)致敏原經(jīng)呼吸道或其他途徑進(jìn)入機(jī)體，機(jī)體在接觸致敏原后，激活T淋巴細(xì)胞并使其分別分化為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞可釋放多種IL，參與哮喘的調(diào)節(jié)。Th1/Th2細(xì)胞的比例和功能失衡，在哮喘發(fā)病過程中扮演著重要的角色[4]。

目前認(rèn)為，Th1細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子可減輕哮喘的氣道炎癥，抑制哮喘發(fā)作。Th1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ，能抑制IgE合成，并抑制IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，起到對(duì)抗、抵消Th2細(xì)胞，以達(dá)到平衡的作用[5]。

Th2細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子則可加重哮喘的氣道炎癥，促發(fā)哮喘。Th2細(xì)胞主要釋放IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等細(xì)胞因子。IL-4可促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，形成漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE。IgE與嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面的高親和性的IgE受體結(jié)合。當(dāng)過敏原再次進(jìn)入體內(nèi)，即可與嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面結(jié)合的IgE結(jié)合，并促使該細(xì)胞合成及釋放多種炎癥介質(zhì)，使氣道平滑肌收縮，黏液分泌增多，氣道黏膜水腫，血管通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致哮喘發(fā)作[6]。IL-5則可調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖、分化，并且，還可通過上調(diào)黏附分子VCAM-1，使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷移并黏附于血管內(nèi)皮。IL-5不但能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化，而且還能進(jìn)一步促使其激活[7]。除此以外，Shi等[8]的研究結(jié)果表明，IL-5還能起到趨化作用，募集嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)到哮喘患者呼吸道，并且激活浸潤(rùn)在呼吸道中的嗜酸粒細(xì)胞。因此，Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-5常作為人們研究哮喘氣道炎癥的重要標(biāo)志物。

目前糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為是防治哮喘最有效的藥物。糖皮質(zhì)激素能抑制氣道炎癥反應(yīng)，有效地控制許多哮喘患者的癥狀。但是對(duì)于部分難治性哮喘、激素依賴性哮喘以及重癥哮喘，糖皮質(zhì)激素療效欠佳[9]。另外，糖皮質(zhì)激素的毒副作用也不同程度地影響其在臨床中的應(yīng)用[10]。因此，人們嘗試尋找一些有效且不良反應(yīng)少的抗炎藥物。屈頭雞是一種生長(zhǎng)在海南、廣東和廣西等我國(guó)南方省份山區(qū)的中草藥。根據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》顯示[2]，屈頭雞果可入藥，性味甘平，口感頗佳，具有療肺止咳、生津利喉、解毒清肝功效，用于咳嗽、哮喘，但成年人每日用量為1～2個(gè)，不可過量，以防中毒。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)屈頭雞果藥用價(jià)值的文獻(xiàn)資料極少，現(xiàn)存的文獻(xiàn)也主要是針對(duì)其食入過量導(dǎo)致中毒的報(bào)道[3]，目前尚無屈頭雞果治療哮喘的報(bào)道。

本研究顯示，屈頭雞果灌胃預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠氣道IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子具有抑制作用，并可激活I(lǐng)L-2、IL-10、IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子，提示屈頭雞果對(duì)哮喘氣道炎癥具有一定的防治作用，這種防治作用可能是通過抑制Th2型細(xì)胞因子、激活Th1型細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的。屈頭雞果對(duì)于哮喘氣道炎癥的抑制作用上，在某些方面雖不及傳統(tǒng)的抗炎藥物糖皮質(zhì)激素，但仍具有進(jìn)一步發(fā)掘的藥用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)同時(shí)也顯示，屈頭雞果的治療劑量和中毒劑量對(duì)氣道炎癥的抑制作用并無顯著性差異，但中毒劑量則可導(dǎo)致動(dòng)物死亡，因此不宜過量食用屈頭雞果。鑒于屈頭雞果有一定毒性，因此目前尚不建議應(yīng)用于臨床。對(duì)于屈頭雞果確切的有效藥理成分與毒性成分，仍有待今后進(jìn)一步深入研究。