鄭 婷，甘麥鄰，李 強，鐘志君，張順華*，朱 礪*

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2．四川省畜牧總站，四川 成都 610041；3. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

動物肌肉組織是人類主要的蛋白質(zhì)來源之一，對于農(nóng)場動物，尤其是肉用家畜來說，產(chǎn)肉是最重要的經(jīng)濟性狀之一，動物骨骼肌的發(fā)育情況直接決定了其產(chǎn)肉能力和肉品質(zhì)。脊椎動物的骨骼肌細(xì)胞是一種經(jīng)過復(fù)雜的分化過程形成的具有收縮功能的多核細(xì)胞。在動物胚胎發(fā)育的過程中，來自中胚層的祖細(xì)胞首先進行增殖，隨后退出細(xì)胞周期在生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors， MRFs）的驅(qū)動下分化、融合成肌管，最終形成肌纖維[1-2]。通常根據(jù)肌纖維表達的肌球蛋白重鏈（Muscle heavy chains， MyHC）亞型的差異可將骨骼肌分為慢速氧化型肌纖維（MyHCⅠ）、快速氧化型肌纖維（MyHCⅡa）、快速酵解型肌纖維（MyHCⅡb）和中間型肌纖維（MyHCⅡx），肌纖維類型決定了肌肉的運動能力和代謝類型，同時還與畜產(chǎn)品肉品質(zhì)密切相關(guān)[3]。在豬中背最長肌是典型的快速酵解型肌肉（又稱白?。蠹榈湫偷穆傺趸图∪猓ㄓ址Q紅?。4]。microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種長度約22nt的非編碼RNA，主要在其靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，近年來越來越多的microRNA被報道參與了骨骼肌的發(fā)育調(diào)控，如miR-1、miR-133、miR-206等[5]。miR-222在此前的研究報道中已被發(fā)現(xiàn)可以抑制骨骼肌細(xì)胞成肌細(xì)胞的分化[6-7]。但miR-222在豬骨骼肌中的表達及其是否調(diào)控豬不同骨骼肌肌纖維類型的發(fā)育還未見報道。因此本試驗以藏豬（地方品種豬）和DLY豬（外種豬）的背最長肌（白?。┖脱蠹。t?。樵囼灢牧?，分析miR-222在背最長肌和腰大肌的表達特性，以期為進一步研究miR-222對豬骨骼肌發(fā)育和肌肉品質(zhì)的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雌性藏豬［體重：（54．60±5．5．56 ）kg，樣品取自甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖基地］和雌性DLY豬（樣品取自成都市某屠宰場）各6頭，分別取背最長?。↙DM）和腰大肌（PMM）。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取

稱取40～50 mg肌肉組織研磨樣于1．5 ml離心管中，加入1 mL Trizol（Ambion） 充 分 裂 解 5 min， 隨后按照說明書內(nèi)容進行RNA提取。使用 Nanodrop2000核酸蛋白儀（Thermo Scientific）對RNA質(zhì)量和濃度進行檢測。

1.2.2 實時定量PCR檢測

分 別 使 用microRNA和mRNA 反 轉(zhuǎn) 試 劑 盒（TaKaRa）反 轉(zhuǎn)cDNA，qRT-PCR采 用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）試劑在CFX96 實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad）下使用 2_ΔΔCt法進行檢測[8]，microRNA和mRNA分別使用U6和GAPDH作內(nèi)參。相關(guān)引物序列見表1。

1.2.3 靶基因預(yù)測

miR-222靶基因預(yù)測使用TargetScan和miRDB軟件，同時結(jié)合序列分析比對的方式進行預(yù)測。

1.3 統(tǒng)計與分析

所有數(shù)值采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20．0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長肌及腰大肌中的表達

由圖1可知，miR-222在藏豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長肌的表達量是腰大肌的 1．40倍（圖 1．A）；miR-222在DLY豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長肌的表達量是腰大肌的 1．51 倍（圖 1．B）。

圖1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長肌（LDM）和腰大?。≒MM）中的表達

圖2 miR-222與PGC1α結(jié)合序列圖示

表1 引物序列及反應(yīng)溫度

2.2 miR-222靶基因PGC1α的序列分析

如圖2所示，miR-222的種子序列與PGC1α的3’UTR區(qū)域2239-3245位序列互補配對。

2.3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長肌和腰大肌中的表達

PGC1α在藏豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰 大 肌 的 45．4%（ 圖 3．A）；PGC1α在DLY豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰大肌的53．7%（圖 3．B）。

2.4 miR-222與PGC1α表達量的相關(guān)性分析

進一步對所有樣本miR-222和PGC1α的表達量進行線性相關(guān)性分析，如圖4。得相關(guān)性方程為：Y=-5458．1X+2．5594（Y ：PGC1α ；X ：miR-222）；R2=0．65；P＜ 0．05。

3 討論

骨骼肌的發(fā)育受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控，microRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制也影響著骨骼肌的發(fā)育。當(dāng)前研究表明一些肌源性microRNA（miR-1、miR-133和 miR-206）和非肌源性 microRNA（miR-378、miR-499、miR-152等）均在骨骼肌發(fā)育過程中扮演著重要角色[9-10]。此前已有研究發(fā)現(xiàn)miR-222可促進成肌細(xì)胞增殖，同時抑制其成肌分化[11]。但目前還未見miR-222在豬骨骼肌發(fā)育的相關(guān)研究報道，本試驗發(fā)現(xiàn)miR-222在成年豬骨骼肌中存在中等程度（U6表達量的0．2%～0．5%）的表達，提示可進一步對miR-222進行功能性研究。本試驗發(fā)現(xiàn)在藏豬和DLY豬中背最長肌miR-222表達水平均高于相同豬種的腰大肌，背最長肌是典型的白肌，腰大肌是典型的紅肌，miR-222在兩個豬種中具有相同的表達模式，暗示miR-222可能參與了豬骨骼肌類型的轉(zhuǎn)換和調(diào)控[12]。同時研究還發(fā)現(xiàn)DLY豬背最長肌和腰大肌中miR-222表達水平均低于藏豬，藏豬是典型的地方品種豬，生長速度和骨骼肌發(fā)達程度均不如DLY豬[13]。miR-222在骨骼肌更發(fā)達的DLY豬種中具有更低的表達模式也暗示了其可能參與骨骼肌發(fā)育調(diào)控，與此前在小鼠上的研究吻合[7，11]。

鑒于miR-222在兩個豬種的腰大肌中表達更低，我們猜測miR-222可能參與了骨骼肌肌纖維類型和能量代謝的調(diào)控。而microRNA調(diào)控是一種經(jīng)典的表觀遺傳調(diào)控，其功能的發(fā)揮必須依靠其靶基因執(zhí)行。過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活因子α(PGC1α)是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，在線粒體含量豐富和氧化代謝活躍的組織中高表達[14-15]。通過軟件預(yù)測和序列比對我們發(fā)現(xiàn)PGC1α的3’UTR區(qū)域存在miR-222種子序列的結(jié)合位點，暗示PGC1α可能是miR-222的潛在靶基因。進一步我們檢測了藏豬和DLY豬背最長肌和腰大肌PGC1α的表達，發(fā)現(xiàn)在藏豬和DLY豬背最長肌中PGC1α的表達量均低于相同豬種腰大肌，與miR-222表達模式相反，且與此前相關(guān)研究結(jié)果相似[16]。進一步對PGC1α和miR-222的表達量進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PGC1α與miR-222存在顯著強負(fù)相關(guān)，進一步提示PGC1α和miR-222的靶標(biāo)關(guān)系。

圖3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長?。↙DM）和腰大肌（PMM）中的表達

圖4 miR-222與PGC1α表達量的相關(guān)性分析

4 結(jié)論

miR-222在藏豬和DLY豬的背最長肌中表達量高于腰大肌，其潛在靶基因PGC1α在藏豬和DLY豬的背最長肌中表達量則低于腰大肌。暗示miR-222可能通過PGC1α參與了豬不同骨骼肌肌纖維發(fā)育的調(diào)控，但其靶標(biāo)關(guān)系還有待進一步驗證。