李曉鋒 張冠軍 汪園園 楊喆 劉希

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，高居癌癥死亡率的首位［1］。其中非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的 75%～85%，大部分患者就診時已為中晚期，5年存活率低［2］。近年來隨著NSCLC多種驅動基因異常的發(fā)現(xiàn)，如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因和C-ros原癌基因1-受體酪氨酸激酶（C-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）融合基因，以它們作為分子靶點的靶向藥物針對性強、療效可靠、不良反應輕，極大地改善了患者的預后，促使NSCLC的臨床治療進入到個體化分子靶向藥物治療時代［3］。

對NSCLC患者進行驅動基因檢測是精準藥物治療的基礎［3］。既往大多數(shù)研究認為肺癌驅動基因的異常是絕對互斥的，即患者僅可能具有單一的驅動基因異常［4-5］。然而最近有少數(shù)研究報道了EGFR和ALK突變共存的NSCLC病例［6-9］，加用ALK抑制劑藥物治療可提高這組患者的總體生存率［6-7］。此外，國內外僅見EGFR和ROS1共存突變的散在個案報道［10-12］。本研究采用擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）方法，對西安交通大學第一附屬醫(yī)院116例NSCLC患者進行EGFR、ALK和ROS1基因聯(lián)合檢測，分析這些驅動基因異常特點及相關的臨床病理特征，旨在探討NSCLC驅動基因異常與患者臨床病理特征的關系，探討驅動基因突變的互斥性及突變共存特點，分析多驅動基因聯(lián)合檢測的意義，為臨床NSCLC患者驅動基因檢測項目的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2018年1月至2018年5月西安交通大學第一附屬醫(yī)院收治住院，行腫物活檢、手術切除或胸腔積液穿刺，并于病理科確診為NSCLC的患者的石蠟組織樣本、胸腔積液細胞塊標本和臨床資料，進行回顧性研究分析。研究經(jīng)我院倫理委員會批準，并征得患者或家屬的知情同意。

所有納入患者在確診前均未接受酪氨酸激酶抑制劑藥物治療。根據(jù)蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學染色結果，按照2015年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）肺腫瘤分類標準進行NSCLC分類［13］。研究共納入116例NSCLC，女性44例（37.9%），男性72例（62.1%）?；颊吣挲g28～86歲，平均年齡51.2歲。無吸煙史61例（52.6%），有吸煙史55例（47.4%）。腺癌93例，鱗狀細胞癌21例，腺樣囊性癌1例，粘液表皮樣癌1例。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的20例（17.2%），Ⅲ～Ⅳ期的96例（82.8%）（表1）。

1.2 方法

1.2.1 ARMS檢測EGFR、ALK和ROS1突變

分別切取石蠟包埋組織4 μm厚切片5～8張，放入2個1.5 mL EP管。脫蠟后，分別按照Amoy-Dx FFPE DNA Kit試劑盒（廈門艾德生物有限公司）和AmoyDx FFPE RNA Kit試劑盒（廈門艾德生物有限公司）說明書提取石蠟標本的DNA和RNA。使用Q5000微量紫外分光光度計（QUAWELL公司，美國）檢測所提取DNA和RNA樣品的質量和濃度。應用ARMS方法，采用ADx-ARMS-人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒（廈門艾德生物有限公司），將提取的DNA樣品進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）反應體系的配置，利用CFX96熒光定量PCR儀（BIO-RAD公司，美國）進行EGFR基因突變檢測。采用ADx-ARMS-ALK+ROS1基因融合聯(lián)合檢測試劑盒（廈門艾德生物有限公司），將RNA樣品進行逆轉錄得到cDNA，再利用該試劑盒進行ALK、ROS1融合基因的qRT-PCR檢測。實驗同時配備陽性和陰性對照，并根據(jù)試劑盒說明書判讀結果。具體檢測的突變類型見表1。

表1 擴增阻滯突變系統(tǒng)方法檢測NSCLC的驅動基因及突變類型Table 1 Detection of the driving genes and mutation types of NSCLC by amplification refractory mutation system

1.2.2 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計分析。比較驅動基因EGFR、ALK、ROS1異常與NSCLC患者臨床病理特點的關系時，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行統(tǒng)計分析計算P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGFR基因突變、ALK或ROS1融合基因特征

116例NSCLC中，42例發(fā)生EGFR突變（36.2%）（圖 1，表 2）。其中 Exon19 del 23例，Exon21 L858R 12例，Exon21 L861Q 2例，Exon20 ins 1例，Exon18 G719X 1例，EGFR外顯子雙重突變3例（表3，圖2）。

116例NSCLC中，8例發(fā)生ALK基因重排（6.9%）（表2），均為ALKExon20與棘皮動物微管相關類蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4）Exon6、13、20 位點融合。而在EGFR突變陰性的74例患者中，7例患者ALK融合基因陽性，陽性率稍增高達9.5%。

圖1 擴增曲線顯示EGFR Exon19 del突變陽性Figure 1 Amplification curve shows positive of EGFR Exon19 del mutation

116例NSCLC中，5例發(fā)生ROS1基因重排（4.3%）（表2）。其中ROS1Exon34基因融合4例，ROS1Exon35基因融合1例。而在EGFR突變和ALK融合基因均為陰性的67例患者中，4例出現(xiàn)ROS1融合基因，陽性率稍增高達6%。

圖242例EGFR突變NSCLC患者EGFR外顯子突變率示意圖Figure 2 Mutation rates of EGFR exons of 42 patients of NSCLC with EGFR mutation

2.2 EGFR基因突變、ALK或ROS1融合基因與臨床病理的相關性

EGFR基因在女性患者中的突變率為52.3%，高于男性患者的26.4%（P=0.005）；在腺癌患者中EGFR的突變率為45.2%，而鱗狀細胞癌等其他非腺癌患者未見EGFR突變（P＜0.000 1）。EGFR突變在患者年齡、吸煙史、臨床分期等方面的差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.218，0.973，0.902）（表2）。

ALK融合基因在年齡小于60歲組中的發(fā)生率為13.5%，高于超過60歲組中的1.6%（P=0.032）。此外，ALK在除年齡外等方面或ROS1融合基因與患者的臨床病理特征中的差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 EGFR、ALK和ROS1基因異常與NSCLC臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between EGFR，ALK and ROS1 gene alterations and the clinicopathological characteristics of NSCLC

2.3 EGFR基因外顯子雙重突變和ALK或ROS1融合基因共存突變分析

116例NSCLC中，EGFR外顯子雙重突變3例，其中Exon18 G719X和Exon20 S768I雙突變1例，Exon19 del和Exon21 L858R雙突變1例，Exon21 L858R和Exon20 T790M雙突變1例（圖2）。值得注意的是，研究檢測出1例晚期年輕女性患者具有EML4Exon6/13/20-ALKExon20融合基因和EGFRExon19 del共存突變（表3）。1例晚期年輕男性患者具有SLC 34A2Exon4/14-ROS1Exon34融合基因和EGFRExon19 del共存突變（表3）。

表3 EGFR雙重突變、EGFR與ALK或ROS1共存突變的NSCLC臨床病理特征Table 3 Clinicopathological features of NSCLC with double exons mutations of EGFR and coexistent alterations of EGFR and ALK or ROS1

3 討論

肺癌作為世界上特別是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，遺傳學上具有很高的異質性［14］。隨著針對NSCLC驅動基因EGFR突變、ALK和ROS1融合基因的一系列酪氨酸激酶抑制劑藥物的開發(fā)，以及臨床分子靶向治療的深入開展，總結分析NSCLC患者驅動基因異常的特點，分析驅動基因的互斥或共存突變特性，有助于加強對NSCLC患者驅動基因檢測的認識，為促進多驅動基因聯(lián)合檢測提供實驗依據(jù)［3，14］。

EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，參與細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等多種信號通路的調節(jié)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變在女性、無吸煙史、腺癌及亞裔人群中的發(fā)生率較高。Shi等［15］在包括來自7個亞洲地區(qū)的1 482例患者的研究顯示，EGFR突變率在亞洲女性中高達61.1%，無吸煙史的患者中為60.7%。本研究結果也顯示EGFR基因在女性患者中的突變率高于男性；在腺癌患者中EGFR的突變率為45.2%，而21例鱗狀細胞癌，1例腺樣囊性癌，1例粘液表皮樣癌患者中均未見EGFR突變。此外，EGFR基因突變主要集中在 Exon18-21，根據(jù) Li等［16］對 5 125 例中國肺癌患者的研究顯示，36.2%的患者發(fā)生EGFR突變，其中Exon19 del突變約占總EGFR突變的49.7%，Exon21 L858R和L861Q突變約占46.7%，EGFR雙重突變約占3.1%。本研究結果與該文獻報道基本一致，Exon19和Exon21為最常見突變的2種外顯子，EGFR雙重突變率為7.1%。EGFR的二次突變如T790M突變是最常見的獲得性耐藥突變機制［17］。值得注意的是，在 Li等［16］的研究發(fā)現(xiàn)在從未接受酪氨酸激酶抑制劑治療的患者中，大約2.4%的患者檢測出T790M或E545K這2種耐藥突變。本研究也在未接受酪氨酸激酶抑制劑治療的患者中檢測出EGFRL858R和T790M雙重突變1例，這些實驗結果表明NSCLC中EGFR基因突變的異質性和復雜性。

NSCLC中ALK融合基因最常見的類型為EML4-ALK融合基因，少部分為KIF5B-ALK和TFG-ALK融合基因［18］。它們產(chǎn)生的融合蛋白可使ALK受體持續(xù)自磷酸化，激活下游信號通路導致細胞惡性轉化［18］。Pan 等［19］利用 qRT-PCR 技術檢測1 139例中國肺腺癌患者ALK融合基因狀態(tài)，結果顯示ALK融合基因陽性率為5.1%，且在小于60歲組中的發(fā)生率為6.7%，高于超過60歲組的3.2%。ALK融合基因陽性在患者性別、吸煙史和臨床分期中的差異無統(tǒng)計學意義［19］。Pan等［19］的研究與本研究結果均顯示在小于60歲的患者中ALK融合基因的發(fā)生率相對更高，因此在臨床上需要重視在年輕患者中ALK融合基因的檢測。

ROS1屬于Ⅱ類受體酪氨酸激酶的胰島素受體家族，ROS1融合基因將異常激活多種下游信號通 路 ，如 RAS-MAPK/ERK、JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR，導致細胞過度增殖、抑制凋亡、促進細胞侵襲和遷徙［19-20］。ROS1融合基因在NSCLC中的陽性率約為1.0%～3.4%，常見于年輕、無吸煙史、亞裔和晚期的NSCLC患者，在EGFR、ALK和KRAS均陰性的患者中，ROS1融合基因的陽性率可達5.7%［19-21］。本研究結果亦顯示5例ROS1融合基因均發(fā)生于腺癌和晚期NSCLC患者，但限于樣本量有限，仍有待進一步累積病例進行統(tǒng)計分析。

Zhang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在 103例中國 NSCLC患者中，ALK融合基因陽性率為11.6%；而在同時缺乏EGFR和KRAS突變的腺癌患者中ALK融合基因陽性率升高達42.8%。本研究結果也顯示，ALK融合基因陽性率在EGFR突變陰性患者中較總體患者中稍增高；同樣，ROS1融合基因陽性率在EGFR突變和ALK融合基因均為陰性的患者中較總體患者中稍增高。這些結果也證實肺癌驅動基因的激活突變具有一定程度的互斥現(xiàn)象。

盡管既往研究認為肺癌驅動基因的激活突變是絕對互斥的［4-5］。但最近有少數(shù)研究報道了EGFR和ALK突變并存的NSCLC病例，這些病例特點是大部分為女性患者、亞裔、無吸煙史的晚期NSCLC患者［6-7］。并且與傳統(tǒng)觀點認為ALK融合基因會導致EGFR突變患者對酪氨酸激酶抑制劑耐藥不同［23］，研究顯示對ALK和EGFR共存突變的患者加用ALK抑制劑治療，可提高患者的總體生存率［6-7］。此外，國內外僅見EGFR和ROS1共存突變的散在個案報道，主要發(fā)生于非吸煙的腺癌患者［10-12］。本組研究檢測出1例35歲女性腺癌晚期患者具有EML4-ALK融合基因和EGFRExon19 del突變，1例29歲男性腺癌晚期患者具有ROS1融合基因和EGFRExon19 del突變。此類病例仍需要累積資料研究，有研究提出同時應用多種靶向藥物聯(lián)合治療可能使這一組罕見NSCLC患者受益［12］。

綜上，本研究采用擴增阻滯突變系統(tǒng)方法對116例NSCLC進行EGFR、ALK和ROS1基因聯(lián)合檢測，結果顯示女性、較年輕的、腺癌患者常常出現(xiàn)驅動基因的突變。NSCLC驅動基因異常具有一定的互斥性，但少數(shù)年輕患者仍可具有EGFR和ALK或ROS1共存突變。因此，在治療初期的多驅動基因聯(lián)合檢測，對促進NSCLC分子靶向藥物聯(lián)合治療具有重要意義。