鄭孝振 毛珊珊 任益鋒 韓簫笛 宋俊杰

舒芬太尼是緩解急慢性疼痛的常用麻醉藥物，但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用后會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受，從而對(duì)患者的疼痛控制及生活質(zhì)量產(chǎn)生不良后果［1］。已有研究發(fā)現(xiàn)N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體在體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性及痛覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［2］。NMDA 受體 2B（NMDA receptor 2B，NR2B）是NMDA受體的一個(gè)重要亞基，參與外周痛覺(jué)感受閾擴(kuò)大、中樞過(guò)度興奮及痛覺(jué)過(guò)敏的形成，可促進(jìn)患者疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺(jué)敏化形成［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，脊神經(jīng)結(jié)扎疼痛模型小鼠經(jīng)鞘內(nèi)注射NR2B亞基的選擇性抑制劑后，小鼠疼痛反應(yīng)有明顯減弱的趨勢(shì)，提示NR2B表達(dá)水平與痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持密切相關(guān)［4］。目前NR2B基因表達(dá)在舒芬太尼耐受中的作用報(bào)道較少。本課題擬體外合成并篩選出針對(duì)NR2B基因的有效siRNA，經(jīng)采用鞘內(nèi)注射將siRNA導(dǎo)入舒芬太尼耐受模型小鼠體內(nèi)，研究脊髓背角NR2B表達(dá)水平在舒芬太尼耐受形成中的作用，為改善慢性疼痛患者生活質(zhì)量提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)及模型構(gòu)建

選擇32只Wistar成年雄性小鼠，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（浙）2014-0001，小鼠體重在290～310 g。飼養(yǎng)室溫度為（24±3）℃，空氣濕度為60%左右，維持自然晝夜節(jié)律，小鼠均可自由飲食。小鼠隨機(jī)分為2組，均為16只，A組作為舒芬太尼假耐受對(duì)照，采用逐日遞增法皮下注射生理鹽水，第1天注射1 mL，每天遞增0.1 mL注射劑量，共21天。B組采用每天遞增法經(jīng)皮下注射舒芬太尼，其注射劑量（mL）與對(duì)應(yīng)的A組注射的生理鹽水體積相同。

1.2 舒芬太尼耐受小鼠模型的評(píng)估

1.2.1 機(jī)械縮足反射閾值的測(cè)定

在第5天、10天、15天、20天、25天、30天將小鼠置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，采用弗雷纖維絲（VonFrey纖維）對(duì)小鼠精修機(jī)械感應(yīng)閥值測(cè)試，待小鼠適應(yīng)3天后，用弗雷纖維絲刺激小鼠后肢足底，持續(xù)刺激3 s左右，刺激強(qiáng)度由小到大，每次間隔30 s，若小鼠發(fā)生5次以上的縮足反應(yīng)，則把該強(qiáng)度設(shè)為小鼠機(jī)械縮足反射閾值。

1.2.2 熱縮足反射潛伏期的測(cè)定

在第5天、10天、15天、20天、25天、30天將小鼠放入輻射熱測(cè)痛儀的玻璃格子中，實(shí)驗(yàn)前使小鼠適應(yīng)環(huán)境15 min，調(diào)節(jié)光源與石英玻璃板之間的距離，觀測(cè)小鼠的縮足反應(yīng)，重復(fù)測(cè)量3次小鼠的熱刺激縮足潛伏期，刺激相同部位的時(shí)間間隔在15 min，不同部位間隔5 min。熱刺激縮足潛伏期指啟動(dòng)光源照射至小鼠發(fā)生縮足反射的時(shí)間。若光源照射小鼠30 s無(wú)反應(yīng)，則停止照射，每只小鼠檢測(cè)3次。熱刺激強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持一致。

1.3 siRNA-NR2B對(duì)脊髓背角細(xì)胞NR2B基因的敲減效果

1.3.1 siRNA-NR2B設(shè)計(jì)、合成和體外篩選

根據(jù)小鼠NR2B基因序列和siRNA設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)針對(duì)NR2B的siRNAs，由上海銳賽生物技術(shù)有限公司合成，設(shè)計(jì)3個(gè)siRNA序列并設(shè)計(jì)相應(yīng)反義寡核苷酸，同時(shí)設(shè)計(jì)一條含4個(gè)堿基錯(cuò)配的siRNAs作為陰性對(duì)照。采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)脊髓背角細(xì)胞（購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司），置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至12孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，對(duì)細(xì)胞用不同的siRNA處理，均為20 nmol/L，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法包封siRNAs，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)脊髓背角細(xì)胞，見(jiàn)表1。

表1 siRNA-NR2B堿基序列Table 1 The base sequence of siRNA-NR2B

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)脊髓背角細(xì)胞NR2B基因的mRNA水平影響

收集對(duì)數(shù)期脊髓背角細(xì)胞，加入TRIZol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，采用Nanodrop分光光度儀檢測(cè)RNA質(zhì)量，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH基因作為內(nèi)參。NR2B基因引物：上游5′-GCTGACTGCACTGCACTGCAC-3′，下游 5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′；GAPDH引物：5′-CGTGCACGTGCACGTCACTC-3′，下游 5′-GCACTGCACTGCACTGCAC-3′。PCR 條件設(shè) 置：95℃2 min；95℃ 30 s，58℃ 25 s，72℃ 40 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)水平。

1.3.3 Western blot技術(shù)檢測(cè)siRNA對(duì)脊髓背角細(xì)胞NR2B蛋白的水平

收集對(duì)數(shù)期脊髓背角細(xì)胞后，加入預(yù)冷的蛋白提取液，置于0℃條件裂解30 min，后以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，經(jīng)二喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)蛋白水平。將蛋白樣品與上樣液混勻后煮沸5 min，冷卻后用加樣槍轉(zhuǎn)入加樣孔中，采用10%十二酰硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，上樣量均為100 μg，電壓120 V，電泳時(shí)間60 min左右，待溴酚藍(lán)染料移至凝膠底部1/3處停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)含5%脫脂奶粉的封閉液孵育30 min后，加鼠抗人NR2B蛋白單抗（按1∶600比例稀釋），4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST清洗后加入兔抗鼠二抗（按1∶2 000比例稀釋），置于搖床孵育2 h，經(jīng)TBST清洗后加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，經(jīng)顯影、拍照后采用膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 siRNA對(duì)模型小鼠行為及脊髓背角細(xì)胞NR2B表達(dá)影響

1.4.1 siRNA對(duì)模型小鼠行為

機(jī)械縮足反射閾值的測(cè)定參見(jiàn)1.2.1步驟；熱縮足反射潛伏期的測(cè)定參見(jiàn)1.2.2步驟。

1.4.2 siRNA對(duì)模型小鼠脊髓背角組織細(xì)胞NR2B表達(dá)影響

小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉深麻醉后斷頭處死，快速取出脊髓背角組織經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗后，經(jīng)胰酶處理5 min，加入TRIZol試劑提取各組細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR檢測(cè)大鼠脊髓背角細(xì)胞NR2B基因的mRNA水平影響（參見(jiàn)1.3.2步驟）。同時(shí)采用Western blot技術(shù)檢測(cè)siRNA對(duì)小鼠脊髓背角組織細(xì)胞NR2B蛋白的水平（參見(jiàn)1.3.3步驟）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均表達(dá)為均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼耐受小鼠的機(jī)械刺激縮足反射閾值變化

表2 舒芬太尼耐受小鼠的機(jī)械縮足反射閾值檢測(cè)（g）Table 2 Detection of mechanical reflex threshold in mice with sufentanil tolerance（g）

與A組相比，B組機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值檢測(cè)均明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)表2、表3。

表3 舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值檢測(cè)（s）Table 3 Detection of paw withdrawal thermal latency of mice with sufentanil tolerance（s）

2.2 siRNA-NR2B對(duì)脊髓背角細(xì)胞的NR2B基因表達(dá)的抑制效果

將siRNA-NR2B轉(zhuǎn)染脊髓背角細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA-1對(duì)脊髓背角細(xì)胞的NR2B的mRNA及蛋白抑制效果較好（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 siRNA對(duì)脊髓背角細(xì)胞的NR2B表達(dá)的影響Figure 1 Effect of siRNA on NR2B expression in spinal dorsal horn cells

2.3 舒芬太尼耐受小鼠的NR2B基因表達(dá)情況

通過(guò)RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼耐受小鼠NR2B基因表達(dá)水平上升（P＜0.05）；將siRNA-1經(jīng)鞘內(nèi)注射舒芬太尼耐受小鼠后，siRNA-1可顯著降低舒芬太尼耐受小鼠脊髓背角組織中NR2B基因的mRNA及蛋白水平（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 siRNA對(duì)小鼠脊髓背角細(xì)胞的NR2B表達(dá)的影響Figure 2 Effect of siRNA on NR2B expression in spinal dorsal horn cells of mice

2.4 siRNA-NR2B對(duì)舒芬太尼耐受小鼠的作用效果

舒芬太尼耐受小鼠轉(zhuǎn)染siRNA 5天后，舒芬太尼耐受小鼠的機(jī)械縮足反射閾值顯著高于B組（P＜0.05）；舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值顯著高于B組（P＜0.05），見(jiàn)表4、表5。

表5 siRNA轉(zhuǎn)染后舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值變化（s）Table 5 Changes of paw withdrawal thermal latency in sufentanil tolerant mice after siRNA transfection（s）

3 討論

臨床醫(yī)療中阿片類藥物對(duì)緩解患者疼痛有重要的作用，但患者在使用阿片類藥物容易發(fā)生藥物耐受，導(dǎo)致提高麻醉藥物的用量，進(jìn)一步導(dǎo)致藥物耐受的加重［5］。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠長(zhǎng)期使用舒芬太尼可促使小鼠發(fā)生痛覺(jué)過(guò)敏，當(dāng)對(duì)小鼠給予適量的氯胺酮（一種NMDA受體拮抗劑）可防止痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生［6-7］。Xie 等［8］發(fā)現(xiàn) NMDA受體拮抗劑可抑制阿片類藥物耐受的發(fā)生。NR2B亞基時(shí)NMDA受體的重要組織部分，對(duì)痛覺(jué)感知和中樞敏化的形成有重要價(jià)值。因此，闡明NR2B亞基對(duì)舒芬太尼耐受形成的作用，有助于臨床治療治療舒芬太尼耐受，提高藥物的鎮(zhèn)痛效果。

本研究通過(guò)采用逐日遞增法皮下注射舒芬太尼的方法建立舒芬太尼耐受小鼠模型，通過(guò)機(jī)械壓痛法測(cè)定小鼠痛域下降，提示舒芬太尼耐受小鼠模型建立成功。NMDA受體激活后可促使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+離子水平上升，促進(jìn)NO的合成，導(dǎo)致小鼠的機(jī)械疼痛閾值下降［9-10］。本研究結(jié)果提示NR2B亞基與舒芬太尼耐受形成密切相關(guān)，可見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓水平NR2B亞基在痛覺(jué)感知、信號(hào)傳遞和阿片類藥耐受過(guò)程中起著重要作用。NR2B亞基作為NMDA受體的重要組成部分，介導(dǎo)疼痛神經(jīng)信息的傳遞，同時(shí)該受體可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外鈣離子及鎂離子水平，鈣離子的細(xì)胞內(nèi)流可活化鈣調(diào)蛋白，刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放產(chǎn)生影響，進(jìn)一步促使NR2B亞基活性增強(qiáng)，通過(guò)自身信號(hào)放大機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)舒芬太尼耐受的形成，選擇性抑制NR2B亞基活性可能是治療麻醉藥物耐受的有效方式。

RNA干擾技術(shù)是一種可特異性抑制目的基因表達(dá)的生物技術(shù)，可特異性阻斷目的基因轉(zhuǎn)錄［11-12］。本研究在設(shè)計(jì)并合成針對(duì)NR2B的siRNA后通過(guò)篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-1可有效抑制NR2B亞基表達(dá)水平。在給予舒芬太尼耐受小鼠siRNA-1后發(fā)現(xiàn)小鼠的機(jī)械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均顯著上升，與已有研究一致［13］。同時(shí)通過(guò)RT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NR2B亞基表達(dá)水平下降，提示NR2B亞基表達(dá)水平舒芬太尼耐受密切相關(guān)，這可能是由于NR2B亞基介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛，該蛋白表達(dá)水平下降可導(dǎo)致痛覺(jué)神經(jīng)元信號(hào)的傳遞功能削弱，進(jìn)而產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛作用［14-15］。NR2B亞基活性基團(tuán)的磷酸化修飾對(duì)神經(jīng)疼痛的調(diào)控有明顯作用，本研究?jī)H檢測(cè)了NR2B亞基表達(dá)水平對(duì)舒芬太尼耐受形成的影響，需同時(shí)檢測(cè)NR2B亞基的磷酸化水平，以更加全面地分析NR2B亞基對(duì)神經(jīng)疼痛調(diào)控的作用。Martel等［16］通過(guò)鞘內(nèi)注射NR2B-iRNA抑制脊髓背角NR2B的mRNA表達(dá)，結(jié)果減輕了外周炎癥引起的疼痛反應(yīng)，表明NR2B在脊髓水平傷害性信息傳遞以及痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮作用。Nakamori等［17］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NR2B亞基在選擇性拮抗劑作用后可緩解疼痛，并可改善記憶障礙等不良癥狀。本研究通過(guò)iRNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)脊髓背角NR2B亞基水平下降后可緩解舒芬太尼耐受形成，提示NR2B亞基可能是治療舒芬太尼耐受的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，NMDA受體NR2B亞基水平上升可促使舒芬太尼耐受的形成，通過(guò)siRNA技術(shù)降低NR2B基因表達(dá)后可有效緩解舒芬太尼耐受，為改善慢性疼痛患者生活質(zhì)量提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。