李嬌 李娜 趙靜妮 李琰清 趙思雨 劉宇峰 李雨薇 牛婧 王亞文，★

宮頸癌是全世界女性高發(fā)癌癥，人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，約有95%的宮頸癌的發(fā)生都與HPV感染有關(guān)［1］。中國食品與藥品監(jiān)督管理局（China Food and Drug Administration，CFDA）規(guī)定將 13種 HPV 高危亞型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）和5種HPV中等風險亞型（HPV26、53、66、73、82）為與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的常見亞型，并用于常規(guī)宮頸癌篩查方案［2］。常見HPV亞型的檢測，在健康女性進行宮頸癌篩查及預防方面已見成效。但在臨床工作中，仍有一些宮頸病變患者，應用現(xiàn)有HPV檢測方法造成漏診，引發(fā)不良結(jié)局。其原因與HPV檢測方法的局限性［3］及病變病理類型的特殊性有關(guān)［4］。本研究將針對HPV檢測亞型的數(shù)量和方法的限制因素，對HPV常見亞型檢測為陰性的宮頸病變患者行HPV少見亞型的檢測，以期了解HPV少見亞型的分布情況，并為疾病病因探索及病程隨訪提供重要補充。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2016年1月至2017年6月在西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦科門診就診，進行宮頸癌聯(lián)合篩查女性12 043例。平均年齡（45.81±11.04）歲，年齡范圍20～76歲。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 HPV DNA分型檢測

①儀器：ABI 2720 PCR擴增儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）、凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀（凱普生物化學有限公司）。②試劑：人乳頭狀瘤病毒（HPV）21分型核酸檢測試劑盒、人乳頭狀瘤病毒（HPV）37分型核酸檢測試劑盒（PCR+膜雜交法）（凱普生物化學有限公司）。HPV 21分型可檢測，包括13種高危亞型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）；6 種低危亞型（HPV6、11、42、43、44、81）。HPV37分型檢測試劑盒在 21種分型的基礎上新增了16種少見亞型（HPV26、34、40、54、55、57、61、67、69、70、71、72、73、82、83、84）的檢測。

1.2.2 病理學診斷

液基細胞自動制片染色系統(tǒng)（安必平醫(yī)藥科技有限公司）及配套宮頸細胞保存液及巴氏染液。

1.3 檢測方法

12 043例女性行HPV 21種分型核酸檢測以及新柏氏液基細胞學技術(shù)（thinprep cytologic test，TCT）檢查，TCT為低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及以上病變者行陰道鏡，取組織進行病理學檢查。病理結(jié)果確診為宮頸病變且HPV 21種基因分型結(jié)果陰性患者，行HPV 37種基因分型補充檢測。

1.3.1 HPV DNA核酸檢測及分型

①DNA分離提?。喊凑誅NA分離提取試劑盒說明書進行DNA提取及擴增。②導流雜交：采用核酸分子快速雜交儀及配套試劑盒，按試劑盒說明書進行導流雜交，酶標顯色。③結(jié)果判讀：檢測結(jié)果為清晰可見的藍紫色圓點。Biotin對照點和內(nèi)對照點為陽性，判定結(jié)果有效。

1.3.2 宮頸細胞及組織病理檢查

根據(jù)2014年子宮頸細胞學Bethesda報告系統(tǒng)（the Bethesda System，TBS）診斷標準［5］，病理科醫(yī)生雙人對檢測結(jié)果進行判讀，本研究以檢測結(jié)果為不明意義非典型細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）及浸潤性宮頸癌（invasive cervical cancer，ICC）患者為研究對象。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）描述。按照HPV檢測方法分為HPV 21分型、HPV 37分型組；按照宮頸病變診斷分為ASCUS、LSIL、HSIL、ICC組。各組間率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸病變患者的HPV感染分布狀況

本研究12 043例行宮頸癌篩查的女性，共篩查出793例宮頸病變患者，其HPV陽性率為74.27%（589/793），各組HPV陽性率分別為ASCUS組 46.23%（43/93）；LSIL組 71.13%（138/194）；HSIL組 76.41%（217/284）；ICC組 86.04%（191/222）各組間陽性率差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。對204例HPV 21分型檢測陰性的患者行HPV 37分型檢測，研究流程及各流程患者HPV感染分布狀況如表1所示。

2.2 HPV 37分型在宮頸病變患者的分布狀況

本研究204例行HPV 37分型檢測的患者，陽性率為22.06%（45/204），HPV 37分型在不同宮頸病變下的檢測結(jié)果及累積陽性例數(shù)與陽性率如表2所示。37分型補充檢測使宮頸病變患者HPV總陽性率增加5.67%（45/793），提高至79.95%（634/793）。2種HPV檢測結(jié)果在各組陽性率分布狀況如圖1所示。

表1 研究流程及患者HPV感染分布狀況（n）Table 1 Study flow and patient flow included in the study（n）

表2 HPV 37種分型基因芯片的檢測結(jié)果Table 2 Results of 37 types of HPV gene chip tests

圖1 HPV 21分型與HPV 37分型在不同宮頸病變的感染分布狀況Figure 1 Distribution of HPV 21 and HPV 37 genotypes in different cervical pathological groups

2.3 少見亞型在宮頸病變的分布情況

45例HPV 37分型檢測的陽性樣本中，22例為HPV 21分型檢測已包含型別，其中單一感染14例，多重感染8例。單一感染以HPV16、52、58、39為主；多重感染中，4例為常見亞型感染，4例為少見亞型和常見亞型混合感染。本研究檢測出8種少見亞型，檢出率分別為HPV54型，3.43%（7/204）；HPV82型，2.45%（5/204）；HPV84型，2.45%（5/204）；HPV61型，1.96%（4/204）；HPV83型，1.47%（3/204）；HPV26 型，1.47%（2/204）；HPV34型，0.98%（2/204）；HPV40型，0.49%（1/204）。其他少見亞型未被發(fā)現(xiàn)。各亞型在不同宮頸病變的分布如表3。其中單一感染35例，多重感染10例，多重感染分布狀況如表4。

表3 少見亞型在HPV陰性宮頸病變患者的感染分布狀況Table 3 Distribution of infection of HPV rare subtype in patients with HPV-negative cervical lesions

表4 不同宮頸病變下HPV多重感染分布狀況Table 4 Distribution of multiple infections of HPV in different cervical lesions

3 討論

本研究在廣泛應用HPV 21分型檢測進行宮頸癌普遍篩查時，發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌患者HPV檢測結(jié)果陰性，其發(fā)生率比既往報道多，因此，選用HPV 37分型對HPV 21分型陰性的宮頸病變患者做進一步檢查，證實了部分患者漏診的現(xiàn)狀。其原因在于HPV 37分型具有更高的靈敏度，且可以檢測出更多HPV亞型。在進行HPV 37分型檢測中，仍有22例為HPV 21分型已包括亞型，而在HPV 21分型檢測中未檢測出來，其原因可能是病毒載量低于HPV 21分型的檢測下限，或HPV 21分型檢測對于某些亞型的擴增效率略低［6］。HPV 37分型相比普通篩查的型別多，可排除由于檢測型別限制造成的假陰性［7］。雖然對人群進行HPV常見亞型的普篩，既可以篩出高風險人群，又可以減少患者由于致病性不高的亞型感染造成的過度恐慌，但對于已經(jīng)確診的患者，其HPV檢測結(jié)果對病因探索、治療和隨訪至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生90%左右都與HPV感染相關(guān)［8-9］，一項全球流行率研究報告稱，13.0%的鱗狀細胞癌和28.2%的罕見宮頸腺癌HPV陰性，并估計常規(guī)HPV檢測可能會漏掉3%～4%的宮頸癌［10］。目前研究已經(jīng)公認，所有已建立和驗證的針對高危型HPV感染的篩查方案，會錯過1%～2%與非高危型HPV感染有關(guān)的宮頸癌［11］。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者有2.45%因為型別限制未被檢出，與以上結(jié)論相一致，而宮頸癌前病變的患者有5.67%在初篩時未被檢出，且具有更高的未檢出率。本研究認為對高危型HPV陰性的宮頸病變患者行少見亞型的檢測，可以為更多患者提供臨床監(jiān)管的機會，并成為臨床鑒別診斷宮頸癌的必要手段。

在對HPV少見亞型分型的研究中，共發(fā)現(xiàn)8種少見亞型的感染。與國內(nèi)外研究相比，羅招云等［6］對285例HPV 21分型未能檢出HPV型別者行37分型檢測，成功分型251例。Igidbashian等［12］對HPV 37例宮頸癌的患者研究表明，31.1%患者在利用HC2檢測高危型HPV為陰性結(jié)果，其中包括1例低危型HPV陽性和1例少見亞型HPV69/71陽性。Petry等［13］在 371例宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)31例高危型HPV檢測結(jié)果為陰性，進一步檢測發(fā)現(xiàn)有少見亞型1例HPV53、1例HPV71及3例HPV73的感染。以上研究表明，HPV“陰性”的宮頸癌中，存在因為檢測型別的限制而導致的HPV檢測假陰性，各研究檢測出的少見亞型型別各不相同，其原因可能與HPV分布的地域特點及HPV少見亞型的感染本就是小概率事件有關(guān)，但都證明了宮頸癌患者中存在HPV少見亞型感染。本研究對象為ASCUS及以上病變患者，比單純宮頸癌患者研究面更廣，感染HPV型別種類更多，且多重感染率更高，可以推測HPV少見亞型雖沒有HPV高危亞型致癌率高，但仍有一定的致癌性，是宮頸病變發(fā)生的原因之一。

本研究仍有159例宮頸病變患者未檢出HPV感染，其HPV感染狀況以及特殊的發(fā)病機制仍需進一步驗證。其原因可能與病毒復制緩慢、異常細胞過少或者嚴重的細胞受損，使病毒載量過低等因素造成的假陰性有關(guān)［14］。也可能與特殊病理類型所致非HPV感染所致宮頸癌有關(guān)［15］。HPV檢測在對疾病病因診斷中仍有局限性，需要臨床工作者進一步研究其特殊病理類型的致癌機制。

綜上所述，本研究認為HPV“陰性”的宮頸癌可能因為漏診，而導致的監(jiān)管和治療不及時，應該加強對此部分患者檢驗方法的彌補。另外，是否存在非HPV感染導致的宮頸癌發(fā)生的特殊致病機制，尚需要大量流行病學深入研究。對HPV檢測結(jié)果為陰性的宮頸病變患者進行少見亞型的檢測，是對原有方法的有效補充，將對該類患者的病因探索、診斷治療以及疾病隨訪提供補充依據(jù)。