竇豆 謝慧 張鋒 李玲瓏

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhino-sinusitis，CRS）是由致病菌引起的鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥，是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的慢性感染性疾病之一，是宿主和環(huán)境多因素相互作用的結(jié)果。研究證實(shí)鼻竇炎的反復(fù)發(fā)作以及難治愈性與鼻-鼻竇細(xì)菌生物膜形成有關(guān)[1，2]。鼻腔菌群通過(guò)相互影響，作用形成生物膜，加大了鼻竇炎的治愈難度，在此過(guò)程的調(diào)控機(jī)制中，目前許多微生物研究表明密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing)，是微生物群體信息傳遞的機(jī)制，細(xì)菌間通過(guò)分泌化學(xué)信號(hào)分子自誘導(dǎo)物(autoindueer，AI)調(diào)控菌屬種群密度及結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，進(jìn)而引起生理行為改變[3，4]。鼻腔中存在桿菌，球菌，革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌等各種細(xì)菌，為形成生物膜提供條件，使得慢性疾病遷延難愈。

為探討CRS患者鼻腔中細(xì)菌表達(dá)情況，使用鼻腔分泌物離體分離培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)膽腑郁熱型鼻淵患者鼻腔菌群及竇口鼻道復(fù)合體分泌SigA與正常人之間的差異，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正常人與患者之間差異性，為臨床實(shí)踐提供思路，為細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)行鋪墊，現(xiàn)具體報(bào)告如下。

資料與方法

1 病例收集

選取2015年11月～2016年5月期間重慶市永川區(qū)中醫(yī)院及成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科門(mén)診符合西醫(yī)慢性鼻-鼻竇炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]（2012，昆明）以及根據(jù)中國(guó)中醫(yī)藥出版社2012年出版的“十二五規(guī)劃教材”《中醫(yī)耳鼻咽喉科學(xué)》[6]中膽腑郁熱證的辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)證候量化評(píng)分在5～9分之間，未行手術(shù)治療，近2月未使用抗生素、糖皮質(zhì)激素口服及噴鼻劑治療，性別不限，年齡在18～60歲之間，自愿受試患者。

2 取樣及實(shí)驗(yàn)方法

嚴(yán)格按照技術(shù)操作規(guī)范，充分消毒內(nèi)窺鏡，帶無(wú)菌手套，以無(wú)菌棉拭子置于受檢者的中鼻甲下外側(cè)即中鼻道，旋轉(zhuǎn)2周半擦取黏膜表面菌群，整個(gè)取樣過(guò)程避免接觸鼻腔側(cè)壁及鼻前庭。采得樣本置于3mL塑料EP管中，管內(nèi)含有1.5ml還原性硫乙醇酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)液。轉(zhuǎn)移樣本于4℃保存不超過(guò)24小時(shí)，于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌鑒定。

3 ELISA標(biāo)本備制及試驗(yàn)

將裝有原始樣本的離心管置于震蕩機(jī)1min，使棉拭子上的細(xì)菌脫落于轉(zhuǎn)運(yùn)液中，后丟棄棉拭子。再將離心管置于高速離心機(jī)中，8000rpm，10min后，用移液槍吸取上清液140ul，-40℃凍存。用于ELISA法檢測(cè)取竇口鼻道復(fù)合處黏膜分泌物生物酶SigA含量，每個(gè)標(biāo)本制作3個(gè)附孔，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

4 觀察指標(biāo)

4.1 細(xì)菌鑒定

使用血平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后挑取單一菌落進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌種鑒定，使用法國(guó)生物梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（型號(hào)VITEK2compact）鑒定優(yōu)勢(shì)菌。

4.2 使用，ELISA試劑盒（南京建成，人分泌型SIgA）檢測(cè)鼻腔黏膜分泌物SigA濃度，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）450mm 檢測(cè)。

結(jié)果

1 進(jìn)行病例證型分析統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，成都地區(qū)膽腑郁熱型鼻淵納入患者約占鼻淵患者就診人數(shù)25.3%，永川地區(qū)膽腑郁熱型鼻淵納入患者約占鼻淵患者就診人數(shù)22.5%。

2 根據(jù)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣本OD值對(duì)應(yīng)濃度。通過(guò)線性式及多項(xiàng)式方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)現(xiàn)R=0.999＞0.99,實(shí)驗(yàn)精確誤差小，可用于統(tǒng)計(jì)。ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3使用SPASS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)研究數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且方差齊，使用t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鼻淵患者與正常人鼻腔分泌物SigA濃度，存在顯著差異（t=3.863，P=0.003＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 不同地區(qū)（成都和重慶永川區(qū)）CRS患者之間鼻腔分泌物SigA含量，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同地區(qū)正常人鼻腔分泌物SigA含量之間，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表1。

表1 慢性鼻竇炎患者與正常人鼻腔分泌物SigA含量對(duì)比

討論

1 川渝地區(qū)患者與正常人，鼻腔分泌物SigA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同地區(qū)人群鼻腔與外界相通雖然受空氣，粉塵，污染物等大氣因素的影響，但對(duì)鼻腔黏膜細(xì)菌分泌物的影響可以忽略不計(jì)，且取樣時(shí)間涉及一年四季，從另一個(gè)方面證實(shí)至少在成都及重慶地區(qū)，外界環(huán)境對(duì)于鼻腔微環(huán)境的影響可以忽略不計(jì)，可以推廣使用同一種安全有效的治療方案。南北方差異，以及長(zhǎng)江流域，黃河流域差異問(wèn)題有待進(jìn)一步大樣本研究。

2 成都及重慶永川地區(qū)慢性鼻-鼻竇炎患者與正常人鼻腔黏膜分泌物SigA差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，取鼻腔菌群進(jìn)行離體培養(yǎng)與鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，鼻竇炎患者鼻腔菌群生長(zhǎng)更快，菌群種類(lèi)相對(duì)于正常人而言更多樣化，60小時(shí)就可鋪滿直徑為10mm血平板。通過(guò)微生物細(xì)菌鑒定，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)地區(qū)鼻竇炎患者中約3%為鏈球菌，4%肺炎球菌及巴氏葡萄球，6%類(lèi)白喉棒狀桿菌，12%為金黃色葡萄球菌，61.1%為表皮葡萄球菌，細(xì)菌種屬過(guò)少無(wú)法確切鑒定出菌種約占9.8%；正常人中約65%為表皮葡萄球菌，30%為金黃色葡萄球菌。鼻腔菌群與正常人對(duì)比而言，菌種類(lèi)繁多，菌落生長(zhǎng)較快。

3 納入慢性鼻竇炎患者時(shí)使用，鼻淵膽腑郁熱證中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)證候評(píng)分，發(fā)現(xiàn)患者平均評(píng)分為6.5分（患者平均年齡36.5歲，男32例，女40例），評(píng)分越高則鼻腔內(nèi)SigA濃度越高，說(shuō)明鼻腔菌群的多少，細(xì)菌對(duì)于鼻黏膜的影響與患者病情呈正相關(guān)。

4 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)，綜合各類(lèi)減少實(shí)驗(yàn)誤差的方法[7]，探究發(fā)現(xiàn)SigA濃度與細(xì)菌濃度有關(guān)，與分泌物量無(wú)關(guān)。此項(xiàng)結(jié)論可以解釋?zhuān)乔淮笮∨c形成病理疾病關(guān)系甚小，疾病形成多與鼻腔結(jié)構(gòu)有關(guān)。

對(duì)鼻淵患者鼻腔細(xì)菌菌種及黏膜分泌物SigA含量的研究，為研究鼻腔細(xì)菌生物膜做鋪墊，治療膽腑郁熱型鼻淵中成藥鼻淵舒口服液，在對(duì)抗細(xì)菌生物膜上存在一定優(yōu)勢(shì)，通過(guò)后期研究，進(jìn)一步論治細(xì)菌生物膜[8]在慢性鼻竇炎中的病理機(jī)制，詳細(xì)研究生物膜群里感應(yīng)型號(hào)AI-2在鼻竇炎患者中的表達(dá)情況，研究中藥制劑對(duì)抗生物膜機(jī)制，更有效地發(fā)揮中醫(yī)中藥的優(yōu)勢(shì)作用。