任列香, 馬建春, 霍宇平, 楊 斌

(呂梁學(xué)院化學(xué)化工系，山西 離石 033000)

萬(wàn)古霉素(vancomycin，以下簡(jiǎn)稱VAC)屬于一種強(qiáng)勁藥效的糖肽類大分子抗生素物質(zhì)，主要用于葡萄球菌(包括耐青霉素和耐新青霉素株)、難辨梭狀芽孢桿菌等所致的系統(tǒng)感染和腸道感染性疾病的治療，如，心內(nèi)膜炎、偽膜性腸炎、敗血癥等。

蛋白質(zhì)是人類生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，約占人體總質(zhì)量的18%，是一種具有生理功能的生物有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)體，是人體細(xì)胞和組織的重要組成部分，同時(shí)也是藥物發(fā)揮藥效的靶分子和重要載體物質(zhì)[1-4]。血清白蛋白(serum albumin)是一種脊椎動(dòng)物血液血漿中最豐富、最容易純化的蛋白質(zhì)，主要是在肝臟中合成，它在維持血液滲透壓、體內(nèi)代謝物質(zhì)的運(yùn)輸和營(yíng)養(yǎng)方面起著極其重要的作用，同時(shí)還能影響動(dòng)脈血管的通透性。牛血清白蛋白(BSA)，相對(duì)分子質(zhì)量為66 000，其中，氮的含量約為16%，脂的含量約為0.2%，糖的含量約為0.08%。其組成成分主要包括581個(gè)氨基酸殘基基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)中還包含有特殊的二硫鍵基團(tuán)和自由巰基基團(tuán)，這種自由巰基基團(tuán)極易與某些小分子物質(zhì)結(jié)合。牛血清白蛋白可以作為一種穩(wěn)定劑、限制酶或修飾酶的保護(hù)溶液和反應(yīng)液。一些酶在添加了牛血清白蛋白后可顯著提高其反應(yīng)活性，所以也常將其作為負(fù)載型載體用于一些復(fù)合材料的制備和合成。牛血清白蛋白較容易得到，因此常被用作各種生化研究中人血紅蛋白的替代物質(zhì)。牛血清白蛋白同時(shí)也是藥物發(fā)揮藥效的靶分子和承載性物質(zhì)，它可以在藥物進(jìn)入到生物有機(jī)體后直接參與藥物在機(jī)體內(nèi)的有效代謝和吸收。迄今為止，藥物與機(jī)體內(nèi)各種蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)制尚沒(méi)有明確的解釋。因此，在模擬生理?xiàng)l件下，經(jīng)常在體外進(jìn)行藥物蛋白結(jié)合的測(cè)定。在研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，牛血清白蛋白已經(jīng)成為現(xiàn)階段最熱門的研究課題[5-10]。

當(dāng)血清白蛋白與小的生物分子結(jié)合后，其性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變。分析彼此結(jié)合的兩者性質(zhì)的變化，能夠判斷其結(jié)構(gòu)信息。與各種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的相互作用，對(duì)于了解這些小生物分子在體內(nèi)和代謝途徑中發(fā)揮作用具有重要意義，它為小生物分子的藥理學(xué)和毒理學(xué)的研究提供了一定的基礎(chǔ)。

鑒于此，本文通過(guò)熒光光譜法，考察研究了萬(wàn)古霉素與牛血清白蛋白在Ca2+和Zn2+存在下的相互作用機(jī)制，結(jié)果表明，其相互作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅機(jī)制，并通過(guò)計(jì)算得到在Ca2+、Zn2+存在下二者的結(jié)合常數(shù)，結(jié)果顯示，Ca2+、Zn2+兩種金屬離子的存在對(duì)于萬(wàn)古霉素與牛血清白蛋白的相互作用基本無(wú)影響。

1 試劑及儀器

牛血清蛋白(BSA)，濃度為1.1×10-5mol·L-1，sigma公司；萬(wàn)古霉素(VCM)，濃度為1×10-3mol·L-1，合肥博美生物科技有限公司，用時(shí)稀釋為5×10-4mol·L-1；氯化鈣溶液，濃度為1.0×10-3mol·L-1；Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.4。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用水均為二次蒸餾水。

pHS-3C酸度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；F-380型熒光分光光度計(jì)，天津港東。

2 實(shí)驗(yàn)方法

主要采用熒光光譜法：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為290 nm～450 nm，狹縫寬度為2.5 nm，在F-380型熒光分光光度計(jì)上記錄290 nm～450 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

準(zhǔn)確移取1.5 mL 1.0×10-5mol·L-1的BSA于1 cm×1 cm四通比色皿中，測(cè)量其熒光發(fā)射光譜，在此基礎(chǔ)上逐漸加入5.0×10-4mol·L-1的VCM溶液，繼續(xù)測(cè)量BSA的熒光發(fā)射光譜。

準(zhǔn)確移取1.5 mL 1.0×10-5mol·L-1的BSA和15 μL 1.0×10-3mol·L-1的CaCl2溶液，反應(yīng)30 min后按照上述方法依次加入VCM溶液繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

準(zhǔn)確移取1.5 mL 1.0×10-5mol·L-1的BSA和15 μL 1.0×10-3mol·L-1的ZnCl2溶液，同上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 VCM及其在Ca2+、Zn2+存在下與BSA猝滅機(jī)制的確定

熒光猝滅是指溶液中猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間的相互作用導(dǎo)致熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)壽命縮短或熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度降低的一種相互作用機(jī)制。圖1～圖3分別為VCM與BSA相互作用的熒光發(fā)射猝滅圖以及分別在Ca2+和Zn2+存在下VCM與BSA的相互作用熒光發(fā)射猝滅圖。對(duì)比圖1～圖3可知，隨著VCM濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低，表明VCM與BSA之間發(fā)生了猝滅作用，并且，隨著VCM濃度的增大，作用增強(qiáng)。從圖2～圖3中還可以看到，金屬離子Ca2+、Zn2+的存在基本不影響VCM與BSA的作用，同時(shí)，BSA的最大發(fā)射峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)基本不變，表明VCM對(duì)BSA的構(gòu)象基本無(wú)影響。

根據(jù)Stern-Volmer方程[11-12]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]，分別得到VCM與BSA以及在Ca2+和Zn2+存在下VCM與BSA作用的Stern-Volmer圖，見(jiàn)第17頁(yè)圖4～圖6。由圖4可知，VCM與BSA作用的猝滅常數(shù)是KSV=2.4×104L·mol-1，因?yàn)樯锓肿拥臒晒鈮勖鼮?0-8s，所以，VCM對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq=2.4×1012L·mol-1·s-1。同理，由圖5得到鈣離子存在下VCM與BSA作用的猝滅速率常數(shù)為Kq=2.05×1012L·mol-1·s-1，由圖6可得鋅離子存在下VCM與BSA作用的猝滅速率常數(shù)為Kq=2.32×1012L·mol-1·s-1。而猝滅劑和各種生物分子的最大猝滅常數(shù)是2.0×1010L·mol-1·s-1，而這3個(gè)猝滅常數(shù)均遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1。因此，VCM在有、無(wú)金屬離子的存在下，與BSA的作用均屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。

圖1 萬(wàn)古霉素與BSA的熒光光譜猝滅圖

圖2 鈣離子存在下萬(wàn)古霉素與BSA的熒光光譜的猝滅圖

圖3 鋅離子存在下萬(wàn)古霉素與BSA的熒光光譜的猝滅圖

3.2 VCM及其在Ca2+、Zn2+存在下與BSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)的確定

研究大分子蛋白質(zhì)與小分子藥物結(jié)合時(shí)，測(cè)定其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)非常重要，可以利用這些信息了解蛋白質(zhì)與藥物的最佳結(jié)合方式。當(dāng)大分子蛋白質(zhì)與小分子藥物結(jié)合時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n與結(jié)合常數(shù)KA可以由式(1)求出[13]。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(1)

按照公式lg[(F0-F)/F]—lg[Q]作雙對(duì)數(shù)曲線，擬合后可得第17頁(yè)表1。由表1可知，金屬離子Ca2+和Zn2+的存在，基本對(duì)VCM與BSA的結(jié)合作用無(wú)影響。表明金屬離子Ca2+和Zn2+的存在不影響人體對(duì)藥物VCM的吸收。

圖4 萬(wàn)古霉素與BSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖

圖5 鈣離子存在下萬(wàn)古霉素與BSA

圖6 鋅離子存在下萬(wàn)古霉素與BSA

4 結(jié)論

綜上所述，萬(wàn)古霉素VCM與牛血清白蛋白BSA以及在金屬離子Ca2+和Zn2+存在下，VCM與BSA作用的熒光均猝滅，且猝滅過(guò)程屬于靜態(tài)猝滅。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中VCM與BSA以絡(luò)合比0.6∶1.0結(jié)合，結(jié)合常數(shù)為3.61×105L·mol-1。此外，還可得到金屬離子Ca2+和Zn2+的存在基本對(duì)VCM與BSA的結(jié)合能力無(wú)影響，即不影響人體對(duì)藥物VCM的吸收能力。

表1 VCM與BSA以及VCM+Mn++BSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、線性相關(guān)系數(shù)