★ 楊軍平 邱麗瑛 肖亮 楊小軍 王瑩（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

“怒”是基于中醫(yī)病因?qū)W說七情中的一種。《儒門事親》載“夫怒傷肝，肝屬木，怒則氣并于肝，而脾土受邪；木太過，則肝亦自病”，肝主升、主動(dòng)，在志為怒，故而怒與肝聯(lián)系緊密。“怒傷肝”需清肝瀉火、疏肝理氣，方以柴胡疏肝散。從現(xiàn)代關(guān)于肝的病理生理學(xué)研究來看，肝的生理和病理變化與人體多個(gè)組織系統(tǒng)關(guān)系密切［1-2］。有研究表明［3-4］：中醫(yī)理論的肝病證候，因應(yīng)激信號(hào)到達(dá)下丘腦、垂體，導(dǎo)致發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能改變。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)的應(yīng)答過程為：胞外刺激因子→“第一信使”→“第二信使”→“第三信使”→靶基因轉(zhuǎn)錄［5］。本課題通過研究受體后傳導(dǎo)通路中第三信使c-fos、c-jun的表達(dá)，從不同作用通路、不同作用環(huán)節(jié)對(duì)柴胡疏肝散的作用機(jī)制進(jìn)行探討。根據(jù)已有的參考資料，對(duì)應(yīng)激所致憤怒的信號(hào)傳導(dǎo)途徑提出如下假設(shè)：c-fos、c-jun是第一、第二信使的靶蛋白，又作為核內(nèi)第三信使啟動(dòng)第一信使（神經(jīng)遞質(zhì)、肽類激素）和下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而形成一個(gè)信息傳導(dǎo)環(huán)路。作用環(huán)節(jié)可能是通過下調(diào)第一信使和第二信使而發(fā)揮作用。本研究將驗(yàn)證上述假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（180±10）g，許可證號(hào)：（贛）2016A023，購(gòu)于江西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境一周，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境22℃～25℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組10只。柴胡疏肝散加減是我院國(guó)家名中醫(yī)饒旺福教授的協(xié)定方，臨床療效顯著［6］，柴胡疏肝散加減由柴胡10g，枳殼10g，香附10g，川芎10g，郁金10g，延胡索10g，炙甘草3g等中藥組成。常規(guī)水煎，分別濃縮成含生藥量0.3g/mL、0.6g/mL、1.2g/mL三種劑量，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器 PTC-100TMPCR儀（MJ Research Inc.公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Ampharmacia公司）；DL-822色譜工作站（大連化物所色譜中心）；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（上海Promega公司）；Tap DNA聚合酶（上海Promega公司）；PCR Mix（上海Promega公司）；370bp DNA ladder（Ivitrogen公司）；兔抗c-fos、兔抗c-jun（上海博耀生物科技有限公司）；免疫組化染色試劑盒、0.01M枸櫞酸鹽緩沖液、DAB顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；圖像采集分析儀器（3Y-international Co. LTD，U.S.A）。

1.3 動(dòng)物造模 雄性Wistar大鼠，室溫、通風(fēng)良好，立體定位器AP-1，RL±1（矢狀面左側(cè)和右側(cè)各1cm）H6處用直流電壓10V，通電30s破壞雙側(cè)膈區(qū)。術(shù)后縫皮，常規(guī)消毒，全部動(dòng)物手術(shù)后24～48h出現(xiàn)明顯的怒行為反應(yīng)：直立、對(duì)峙、嘶咬、鳴叫，對(duì)外界聲響和震動(dòng)反應(yīng)敏感、肌緊張升高，雙目直視對(duì)方、擴(kuò)瞳，有時(shí)恐懼、不安，學(xué)習(xí)、記憶行為減退，這些結(jié)果表明“怒傷肝”大鼠模型成功［7］。

1.4 一般情況觀察 觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲水、攝食、毛發(fā)及活動(dòng)情況等。

1.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬及大腦皮層c-fos、c-jun的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死，迅速取出大腦于冰面上快速分離出海馬、大腦皮層，立即置10%甲醛中固定，進(jìn)行常規(guī)組織脫水、浸蠟、包埋、切片，切片厚約3～4μm。經(jīng)免疫組化染色后，利用光學(xué)顯微鏡觀察、圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像的采集和處理。在光鏡下觀察可見，細(xì)胞核形狀多為圓形或卵圓形，核膜染色略呈黃色顆粒狀，位于胞漿內(nèi)。高倍鏡下，隨機(jī)觀察大鼠腦切片無重疊的視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析所有切片的每個(gè)視野的平均灰度。

1.6 R-T PCR法檢測(cè)大鼠海馬及大腦皮層c-fosmRNA、c-junmRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死，迅速取出大腦，在冰面上快速分離出大腦皮層、海馬，立即置液氮中，隨后于-70℃低溫冰箱中凍存待用。引物：c-fos：擴(kuò)增產(chǎn)物370bp，上游引物：5’-gcc ttt cct act acc att cc-3’下游引物：5’-atc tta ttc ett tcc ctt cg-3’；c-jun：擴(kuò)增產(chǎn)物328bp，上游引物：5’-tac gct gcc cag tgt cac ct-3’下游引物：5’-cgt ctg cgg ctc ttc ctt ca-3’。先提取總RNA，保證純度達(dá)標(biāo)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板反應(yīng)生成cDNA，又以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR測(cè)定基因表達(dá)。取擴(kuò)增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行電泳條帶凈面積分析，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。標(biāo)本mRNA的表達(dá)水平參數(shù)計(jì)算：標(biāo)本mRNA的表達(dá)水平參數(shù)=標(biāo)本靶基因條帶凈面積參數(shù)/內(nèi)參基因的凈面積參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 除正常對(duì)照組外，各組大鼠均出現(xiàn)神態(tài)倦怠、扎堆懶動(dòng)、毛色無光澤、對(duì)食物的辨別反應(yīng)減弱、飲水次數(shù)減少、伴有大便稀溏等現(xiàn)象，有個(gè)別大鼠出現(xiàn)輕微的口鼻出血現(xiàn)象。

2.2 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos和c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響 模型組的大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高，與正常對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。治療后，各給藥組大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)不同程度的降低，與模型組比較，中藥中劑量組降低有顯著差異（P＜0.05）。說明柴胡疏肝散能調(diào)節(jié)大鼠腦組織c-fos和c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

表1 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響（，n=10）

表1 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響（，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 c-fos(海馬） c-fos（大腦皮層） c-jun（海馬） c-jun（大腦皮層）正常對(duì)照組 16.16±3.88 21.30±4.01 14.16±2.82 15.22±3.63模型組 37.75±5.28# 45.61±7.18# 32.68±3.63# 37.46±3.91#中藥低劑量組 35.91±4.81 42.41±7.24 30.33±2.78 35.56±3.75中藥中劑量組 18.00±4.45* 23.10±3.75* 15.56±3.23* 16.66±2.76*中藥高劑量組 34.50±5.13 43.24±6.28 30.11±3.42 35.02±4.19

2.3 柴胡疏肝散對(duì)大鼠c-fos和c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度的影響 模型組的大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度明顯升高，與正常對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。治療后，各給藥組大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度呈現(xiàn)不同程度的降低，與模型組比較，中藥中劑量組降低有顯著差異（P＜0.05）。說明柴胡疏肝散能調(diào)節(jié)大鼠腦組織c-fos和c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度。

表2 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度的影響（，n=10）

表2 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos、c-jun陽(yáng)性細(xì)胞灰度的影響（，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組）正常對(duì)照組 162.42±41.74 151.76±34.05 181.55±38.25 172.68±31.78模型組 256.44±71.72# 251.23±67.64# 298.13±69.69# 303.27±67.74#中藥低劑量組 236.00±66.28 242.57±68.28 296.37±66.35 298.19±70.02中藥中劑量組 172.17±46.02* 161.16±34.53* 192.53±36.55* 181.49±34.78*中藥高劑量組 229.24±65.80 238.49±67.21 269.17±68.74 291.26±68.56

2.4 柴胡疏肝散對(duì)大鼠c-fos mRNA和c-jun mRNA表達(dá)的影響 模型組的大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos mRNA和c-jun mRNA的表達(dá)明顯升高，與正常對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。治療后，各給藥組大鼠腦組織（海馬、大腦皮層）c-fos mRNA和c-jun mRNA表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的降低，與模型組比較，中藥中劑量組降低有顯著差異（P＜0.05）。說明柴胡疏肝散能調(diào)節(jié)大鼠腦組織c-fos mRNA和c-jun mRNA的表達(dá)。

表3 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos mRNA和c-jun mRNA表達(dá)的影響（，n=10）

表3 柴胡疏肝散對(duì)大鼠腦組織c-fos mRNA和c-jun mRNA表達(dá)的影響（，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 c-fos(海馬） c-fos（大腦皮層） c-jun（海馬） c-jun（大腦皮層）正常對(duì)照組 1.36±0.15 1.04±0.13 1.16±0.14 1.02±0.11模型組 10.28±2.89# 11.03±2.61# 9.94±2.41# 11.13±2.75#中藥低劑量組 8.96±2.53 8.49±2.31 8.19±2.79 8.74±2.56中藥中劑量組 5.18±1.04** 6.09±1.96** 5.96±1.53** 6.12±1.73**中藥高劑量組 9.01±2.04 9.25±2.16 8.32±2.12 8.67±2.05

3 討論

“怒則陽(yáng)氣逆上，而肝木乘脾，故甚則嘔血及飧泄也?！迸瓰楦沃?，怒太過，最易傷肝。“怒傷肝”作為情緒應(yīng)激的一種，它的反應(yīng)主要與下丘腦、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、邊緣系統(tǒng)、大腦皮層等部位有著密切關(guān)系，其中邊緣系統(tǒng)在情緒發(fā)生中起重要作用。本研究主要從“怒傷肝”的腦中樞機(jī)制-邊緣系統(tǒng)、大腦皮層著手，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)分析柴胡疏肝散對(duì)“怒傷肝”大鼠海馬及大腦皮層c-fos、c-jun表達(dá)的影響，通過R-T PCR法分析柴胡疏肝散對(duì)“怒傷肝”大鼠海馬及大腦皮層c-fos mRNA、c-jun mRNA表達(dá)的影響，同時(shí)采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)腦中樞機(jī)制部位Fos蛋白、Jun蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步探討中藥調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)與第三信使的機(jī)制關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠c-fos、c-jun表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞灰度值及c-fos mRNA、c-jun mRNA升高，相比差異有顯著性（P＜0.05）。說明“怒傷肝”應(yīng)激可以誘導(dǎo)下腦中樞機(jī)制部位c-fos、c-jun的表達(dá)，作為神經(jīng)中樞的下丘腦參與了應(yīng)激的調(diào)控。與模型組相比，中藥高、中、低組均能使大鼠c-fos、c-jun表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞灰度值及c-fos mRNA、c-jun mRNA呈現(xiàn)不同程度的下降，中藥中劑量組下降明顯，差異顯著（P＜0.05）。推測(cè)降低腦中樞機(jī)制部位c-fos、c-jun為柴胡疏肝散調(diào)節(jié)“怒傷肝”應(yīng)激的可能機(jī)制。

c-fos、c-jun的第三信使假說［8-10］：第一信使是“怒傷肝”這種應(yīng)激把第一級(jí)神經(jīng)元的興奮引起神經(jīng)遞質(zhì)（或激素）分泌的過程。第一信使傳來的信息作用于靶細(xì)胞的細(xì)胞膜，由跨膜將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，激活第二信使，引起靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞的特定反應(yīng)，這些反應(yīng)激活即早基因（c-fos、c-jun）的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)偶聯(lián)第一、第二信使傳來的信息與靶基因表型的改變，形成第三信使［11］。第三信使調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，使細(xì)胞表型發(fā)生改變，通過神經(jīng)系統(tǒng)的生理反應(yīng)來調(diào)控細(xì)胞。柴胡疏肝散調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)系通過腦組織以外的自主神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，均與c-fos、c-jun有關(guān)系，提示c-fos、c-jun是“怒傷肝”應(yīng)激機(jī)制中一個(gè)不可缺少的環(huán)節(jié)，“怒傷肝”參與應(yīng)激有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，有可能由于受到第二信使的誘導(dǎo)。