★ 王章偉 王振 邱小燕 劉芳芳 周鵬 張功俊 楊小玲 呂武清 謝寧 *（1.江西青峰藥業(yè)有限公司 江西 贛州 341000；.創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西 贛州 341000）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效，用于積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、瀉痢后重、大便不通、痰滯氣阻、胸痹、結(jié)胸、胃下垂、脫肛、子宮脫垂［1］等癥。文獻(xiàn)報(bào)道，枳實(shí)中主要含有黃酮類［2］、生物堿類［3］、揮發(fā)油類［4］、香豆素類［5］等成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，香豆素類化合物在嚙齒類動(dòng)物中存在著明顯的肝臟毒性，且具有種屬和位點(diǎn)特異性，這與其代謝途徑和CYP2A6酶的多態(tài)性有關(guān)。另外，毒性作用與給藥劑量和給藥途徑密切相關(guān)，口服和高劑量給藥更容易產(chǎn)生毒性反應(yīng)，但香豆素及其衍生物的毒性作用具有明顯的閾值范圍，只有在高于臨床劑量時(shí)才會(huì)產(chǎn)生毒性作用，日常攝入量不會(huì)對人體產(chǎn)生不良的肝臟效應(yīng)和致癌作用［6］。新藥品種的潛在安全性問題，是新藥審評中專家關(guān)注的重點(diǎn)，因此，需嚴(yán)格控制產(chǎn)品中具有潛在毒性的香豆素類成分的含量限度。

枳實(shí)總黃酮苷提取物為自主研制的中藥5類新藥原料藥，由江西道地藥材蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL枳實(shí)，經(jīng)水提取、分離、純化制成，總黃酮苷含量大于90%，用于治療功能性消化不良［7-9］。LIU W Y 等［10］采用 LC-MS，建立了枳實(shí)醇提取物多成分同時(shí)定量測定的方法，并明確柚皮苷和新橙皮苷等可測有效成分的含量大于60%；韋錦寧等［11］采用HPLC法建立了枳實(shí)總黃酮苷提取物的特征圖譜，有效控制了枳實(shí)總黃酮苷提取物中黃酮苷類成分的含量，但未對枳實(shí)總黃酮苷提取物中具有潛在毒性的香豆素類成分進(jìn)行限度控制。為了全面控制原料藥的質(zhì)量，確保制劑產(chǎn)品的安全性，筆者對枳實(shí)總黃酮苷提取物進(jìn)行了系統(tǒng)化學(xué)成分研究，除黃酮類成分外，還分離得到3個(gè)香豆素類化合物。本研究采用HPLC法同時(shí)對枳實(shí)總黃酮苷提取物中3個(gè)香豆素類活性成分：傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素、馬爾敏進(jìn)行含量測定，旨在完善枳實(shí)總黃酮苷提取物的質(zhì)量控制體系，對保障該品種的安全性具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀；賽多利斯CP225D型十萬分之一電子天平；島津UV-2550紫外分光光度計(jì)；美國Thermo Fisher Nicolet is5紅外光譜儀；美國Agilent 1100 Series LC/MSD Trap SL；BRUKER AV-500型核磁共振譜儀。

1.2 試藥 傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素、馬爾敏為江西青峰藥業(yè)有限公司自制，通過1H-NMR、13C-NMR、MS、IR等信息確證結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC面積歸一化法計(jì)算純度依次為99.2%，98.5%，98.0%；枳實(shí)總黃酮苷提取物為江西青峰藥業(yè)有限公司自制（批號：080215，090209，090212，090215，090401，110415，120810，140305，140311，140315）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，作為單一對照品儲(chǔ)備液；精密量取適量單一對照品儲(chǔ)備液，加50%甲醇制成含傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷0.4μg/mL、5，7-二羥基香豆素9.0μg/mL、馬爾敏0.2μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取枳實(shí)總黃酮苷提取物約500mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過（0.45μm），取續(xù)濾液，即得。

2.3 檢測波長選擇 取各對照品溶液，照紫外-可見分光光度法在190～400nm范圍內(nèi)掃描。

傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏的最大吸收波長均在325nm附近，因此選擇325nm作為檢測波長。

2.4 色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A（4.6mm×250mm， 5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～30min，10%～13%A；30～40min，13%～35%A ；40～50min，35%～35%A ；50～51min，35%～10%A ；51～60min，10%～10%A ；檢測波長：325nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；理論塔板數(shù)按5，7-二羥基香豆素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000，各化合物與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，對照品及供試品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品10.14mg、5，7-二羥基香豆素對照品13.02mg和馬爾敏對照品15.74mg，分別置于50mL，50mL，100mL量瓶中，加甲醇溶液溶解稀釋至刻度，制成單標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取不同體積的單標(biāo)儲(chǔ)備液，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，制成含傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷濃度依次為0.0909，0.2271，0.3634，0.4543，0.6814，1.8171，9.7344μg/mL、5，7-二羥基香豆素濃度依次為2.0832，5.2080，8.3328，10.4160，15.6240，20.8320，31.2480μg/mL和馬爾敏濃度依次為0.0403，0.1007，0.1612，0.2015，0.3022，0.8059，1.2592μg/mL的混合對照品溶液。

精密吸取各濃度的混合對照品溶液20μL，分別注入高效液相色譜儀，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定。橫坐標(biāo)（X）為對照品質(zhì)量濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)（Y）為峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各化合物在相應(yīng)線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 3個(gè)香豆素類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液20μL，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰面積的RSD值（n=6）分別為0.2%，0.1%，0.3%，保留時(shí)間的RSD值（n=6）分別為0.2%，0.1%，0.1%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品（批號：120810），依照“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液。精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各20μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。測得傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏的平均含量（n=6）分別為0.0229，0.3889，0.0042μg/mg，RSD值（n=6）分別為1.3%，1.2%，1.4%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液（批號：120810）20μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，分別在0，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰面積的RSD值（n=6）分別為1.7%，1.3%，1.3%，表明供試品溶液在常溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 檢測限（LOQ）和定量限（LOD） 取混合對照品溶液，用50%甲醇逐級稀釋后進(jìn)樣測定，以信噪比約3∶1時(shí)的相應(yīng)濃度計(jì)算檢測限，以信噪比約10∶1時(shí)的相應(yīng)濃度計(jì)算定量限。計(jì)算傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰的檢測限（S/N=3）分別為0.5ng、0.3ng和0.3ng，定量限（S/N=10）分別為1.6ng、0.9ng和0.8ng。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含量已知的枳實(shí)總黃酮苷提取物6份（批號：120810，傘形花內(nèi)酯 7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→ 2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏的含量分別為0.0229，0.3889，0.0042μg/mg），每份約250mg，精密加入對照品溶液適量（含傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷 5.6784μg、5，7- 二羥基香豆素 118.08μg、馬爾敏1.0106μg），依照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。計(jì)算傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰的平均加樣回收率（n=6）分別為99.5%，97.9%，99.9%；RSD值分別為1.4%，1.3%，1.7%。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.7 枳實(shí)總黃酮苷提取物中3個(gè)香豆素類成分含量測定 各批次樣品分別取2份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各20μL，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

表3 枳實(shí)總黃酮苷提取物中3種香豆素類成分含量測定/%

3 討論與分析

3.1 色譜條件的選擇 本文采用梯度洗脫法測定多批次枳實(shí)總黃酮苷提取物中3個(gè)香豆素類成分的含量，60min內(nèi)完成分離，傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰的分離效果良好，符合含量測定要求。本文采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行掃描（190～400nm），3個(gè)香豆素類化合物的最大吸收波長均在325nm附近，因此選擇325nm作為檢測波長。流動(dòng)相優(yōu)選時(shí)分別考察了流動(dòng)相B中的磷酸濃度和不同品牌色譜柱對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果顯示流動(dòng)相B中的磷酸濃度在0.05%～0.2%和使用不同品牌色譜柱時(shí)，樣品中各成分色譜峰分離度好，RSD值小于2.0%，說明該方法的耐用性良好。

3.2 含量測定 由表2可知：10批次枳實(shí)總黃酮苷提取物中傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰的含量批次間存在一定的差異，含量范圍分別為0.003%～0.030%，0.020%～0.049%，0.003%～0.004%，各批次樣品3個(gè)香豆素化合物含量之和范圍為0.038%～0.055%，均在安全劑量范圍之內(nèi)。因此，為確保各批次樣品香豆素類化合物的含量在限度內(nèi)穩(wěn)定，保障臨床用藥的安全性，需加強(qiáng)工藝過程中的參數(shù)控制，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

3.3 小結(jié) 采用HPLC法同時(shí)測定10批次枳實(shí)總黃酮苷提取物中傘形花內(nèi)酯7-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、5，7-二羥基香豆素和馬爾敏峰的含量，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，有效的控制了潛在毒性成分的含量，為枳實(shí)總黃酮苷提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和多指標(biāo)質(zhì)量控制體系的建立提供了科學(xué)依據(jù)，對保障該品種的安全性有重要的指導(dǎo)意義。