劉茂順,葛乃嘉,蘇益平,張藝瓊,陸 釗

(吉林醫(yī)藥學院：1.檢驗學院,2.公共衛(wèi)生學院,3.藥學院,吉林 吉林 132013)

淫羊藿最早記載于《神農草本經》，屬小檗科草本植物，有抗腫瘤、強壯筋骨、祛風濕、補腎壯陽等功效[1]。《中國藥典》中收錄5種淫羊藿：朝鮮淫羊藿、巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿以及淫羊藿[2]。朝鮮淫羊藿中總黃酮的提取工藝多采用不同含量的乙醇回流提取法[3-4]，該法存在加熱時間過長、提取率較低、提取次數(shù)過多的缺點[5-6]。本實驗利用堿提酸沉法提取朝鮮淫羊藿中總黃酮，避免了乙醇提取的諸多問題，采用正交設計優(yōu)化提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

朝鮮淫羊藿(采自長白山地區(qū)，經吉林市藥檢所鑒定確認)；蘆丁對照品(色譜純，國藥集團)；NaOH(分析純，天津市科密歐化學試劑公司)；Al(NO3)3(分析純，天津市光復精細化工研究所)；NaNO2(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；甲醇(分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠)；蒸餾水為本院自制。

紫外可見分光光度計(UV-1800型，日本島津)；JY2001型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 供試品溶液的制備

將朝鮮淫羊藿葉除塵清理干凈，低溫干燥至恒重，粉碎。精密稱取粉末5.0 g,置250 mL圓底燒瓶，加100 mL濃度為0.3% NaOH溶液回流提取1 h,提取液濃縮，濾液置于50 mL容量瓶中，50%甲醇定容，即得供試品溶液。取1 mL，按標準曲線方法顯色，在510 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.3 對照品溶液的制備

稱取105 ℃干燥的蘆丁標準品20 mg，置于50 mL容量瓶中，加10 mL 50%甲醇，60 ℃水浴微熱溶解，冷卻至室溫。定容，搖勻，即得0.4 g/L的對照品溶液。

1.4 測定對照品最大吸收峰

精密量取對照品溶液2 mL置于50 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液1 mL。搖勻，放置6 min，加10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加入50%甲醇至10 mL，最后加4%NaOH溶液10 mL，放置15 min，50%甲醇定容，搖勻。另取同樣體積的50%甲醇作為空白，紫外分光光度計光譜掃描。

1.5 線性關系考察

精密吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，按照標準曲線法顯色處理，于510 nm處測量吸光度值。以蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標做標準曲線。

1.6 單因素實驗考察

經預實驗，發(fā)現(xiàn)影響提取量的主要因素有NaOH濃度、提取時間、提取次數(shù)、料液比。通過對上述單因素實驗考察確定各因素作用范圍，為朝鮮淫羊藿總黃酮提取正交實驗提供數(shù)據(jù)。

1.6.1NaOH濃度對總黃酮提取量的影響

精密稱取5.0 g粉碎過篩好的朝鮮淫羊藿粉末5份，分別置于5只250 mL圓底燒瓶中。選取NaOH溶液濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，溶液回流提取1 h，得到粗提取液。量取1 mL，50%甲醇定容至10 mL，按標準曲線方法顯色，于510 nm處測定吸光度值，平行測試3次，取平均值，計算總黃酮含量。

1.6.2提取時間對總黃酮物含量提取的影響

精密稱取5.0 g粉碎過篩好的朝鮮淫羊藿粉末5份，分別置于5只250 mL圓底燒瓶中，分別加100 mL 0.3% NaOH溶液回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，得到粗提取液。取1 mL，按標準曲線方法顯色，定容至10 mL于510 nm處測定吸光度值，平行測試3次，取平均值，計算總黃酮含量。

1.6.3提取次數(shù)對總黃酮物含量提取的影響

精密稱取5.0 g粉碎過篩好的朝鮮淫羊藿粉末5份，分別置于5只250 mL圓底燒瓶中，分別加100 mL 0.3 % NaOH溶液回流提取1 h，提取5次合并各粗提取液。取1 mL按標準曲線方法顯色,定容至10 mL,于510 nm處測定吸光度值，平行測試3次取平均值，計算總黃酮含量。

1.6.4料液比對總黃酮物含量提取的影響

精密稱取5.0 g粉碎過篩好的朝鮮淫羊藿粉末5份，分別置于5只250 mL圓底燒瓶中，選取料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)濃度為0.3% NaOH溶液回流提取1 h，得到粗提取液。量取1 mL，定容至10 mL，按標準曲線方法顯色，于510 nm處測定其吸光度值，平行測試3次，取平均值，計算總黃酮含量。

1.7 朝鮮淫羊藿總黃酮堿提取正交試驗

選擇提取次數(shù)、料液比、提取溶劑(NaOH濃度)、提取時間為考察因素，參考單因素試驗結果，以朝鮮淫羊藿樣品中的總黃酮含量為指標，選用L9(34)正交表設計試驗方案確定朝鮮淫羊藿堿提取的最佳工藝條件[7]。

1.8 濃縮比例和酸用量條件考察

1.8.1濃縮比例對朝鮮淫羊藿總黃酮物含量的影響

稱取干燥朝鮮淫羊藿粉末25 g，根據(jù)正交實驗的最優(yōu)方案進行提取。將所得提取液平均分成5份，其中4份提取液按照料液比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1(g/mL)濃縮，剩余1份不做濃縮處理。用1 mol/L鹽酸調節(jié)pH至3。靜置12 h后，量取1 mL，定容至10 mL，按標準曲線方法顯色，于510 nm處測定吸光度值(A)，平行測試3次，取平均值，計算總黃酮含量。

1.8.2酸用量對朝鮮淫羊藿總黃酮物含量的影響

稱取干燥朝鮮淫羊藿粉末25 g，根據(jù)最佳提取工藝方案進行提取，將所得到的提取液濃縮至約400 mL。量取4份50 mL濃縮液，并用1 mol/L鹽酸調節(jié)pH=1、2、3、4、5，靜置12 h后，量取1 mL，定容至10 mL，按標準曲線方法顯色，于510 nm處測定吸光度值(A)，平行測試3次，取平均值，計算總黃酮含量。

1.9 方法學考察

1.9.1精密度試驗

使用移液管精密量取蘆丁對照品溶液1 mL，共5份。按線性關系考察項下方法進行顯色操作，并測定吸光度值。

1.9.2穩(wěn)定性試驗

精密稱取5.0 g朝鮮淫羊藿粉末，最佳工藝條件提取，提取液按線性關系考察項下方法操作，在0、2、4、8、12 h測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.9.3重復性實驗

精密稱取朝鮮淫羊藿5.0 g 5份，最佳工藝條件提取，提取液按線性關系考察項下方法制備樣品后測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.9.4加樣回收實驗

準確稱取5.0 g朝鮮淫羊藿粉末，最佳工藝條件提取，量取粗提取液5份，每份1 mL置10 mL容量瓶中，分別加入蘆丁對照品溶液(0.2 g/L)0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按線性關系考察項下方法制備樣品后測定吸光度值。

1.10最優(yōu)條件提取樣品總黃酮

精密稱取5.0 g粉碎過篩好的朝鮮淫羊藿粉末，按最優(yōu)工藝條件提取，提取液取1 mL，按標準曲線方法顯色，在510 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量。

2 結果與分析

2.1 對照品最大吸收峰的紫外光譜掃描結果

圖1結果顯示，蘆丁在510 nm處有較平緩的吸收峰，故確定510 nm為測定蘆丁最大吸收波長。

圖 1 蘆丁紫外光譜掃描曲線

2.2 蘆丁標準曲線

蘆丁質量濃度X(mg/L)與吸光度Y關系曲線，回歸方程和相關系數(shù)為y=10.938x+0.002 5(R2=0.999 5)，在1～5 mg/L范圍內有良好線性關系。

2.3 提取溶劑對朝鮮淫羊藿總黃酮含量的影響

朝鮮淫羊藿各種溶劑中的含量分別為水：1.96%,0.5%酸水(pH=2)：1.51%,0.2% NaOH：4.33%,0.4% NaOH：3.28%。在堿水(稀NaOH溶液)中提取的總黃酮含量較高，在水中和酸水中提取的含量較低。原因是在堿性條件下黃酮類化合物易開環(huán)生成查耳酮型結構，顏色多為黃色、褐色和橙色；在酸性條件下查耳酮重新恢復成閉環(huán)結構，顏色消失。所以選擇稀NaOH溶液作為提取溶劑。

2.4 單因素實驗結果

2.4.1NaOH濃度對總黃酮含量提取的影響

NaOH濃度為0.3%時總黃酮提取效果最好，濃度在0.3%之前，濃度越高提取量越大，在0.3%之后，濃度越高提取總黃酮量反而越少。這是由于NaOH濃度過高時破壞了總黃酮的結構，導致總黃酮提取量減少。故選擇堿提朝鮮淫羊藿總黃酮的提取溶劑為0.3%的NaOH溶液。

2.4.2提取時間對總黃酮物含量提取的影響

隨著提取時間的增加，朝鮮淫羊藿總黃酮含量是逐漸增大，當時間達到2 h后，增加量沒有顯著變化。另外隨著時間增加雜質含量也會增多，不利于接下來的分離純化。因此，提取時間在2 h為宜。

2.4.3提取次數(shù)對總黃酮物含量提取的影響

隨著提取次數(shù)的增加，朝鮮淫羊藿總黃酮含量逐漸增加，提取2次后，增加量無顯著變化。綜合熱量、時間、溶劑等因素考慮，2次提取效果最佳。

2.4.4料液比對總黃酮物含量提取的影響

隨著料液比的增加總黃酮含量也相應增加，但到比例為1∶40(g/mL)后增加量變化不大，從節(jié)約成本角度考慮，選擇料液比1∶40(g/mL)為宜。

由此確定正交實驗因素水平(表1)。

表 1 正交因素水平表

2.5 正交實驗結果

正交實驗結果見表2,極差分析可知，堿提取朝鮮淫羊藿中總黃酮的主次影響素為：提取溶劑>提取次數(shù)>料夜比>提取時間。方差分析結果表明，因素C(提取溶劑)對提取結果影響最大，其次是因素A(提取次數(shù))，其他因素不明顯。根據(jù)分析結果，綜合工藝成本，簡單可行等因素得出最佳提取工藝條件為A2B2C3D2，即提取次數(shù)2次，料液比1∶40(g/mL)，提取溶劑為0.3%NaOH溶液,提取時間為2 h。

表 2 正交實驗結果與直觀分析表

2.6 濃縮比例對朝鮮淫羊藿總黃酮含量的影響

結果顯示，濃縮比例提高，總黃酮的含量也隨之提高，濃縮比例為1∶4時含量值達到最高點(6.45%)，但隨著濃縮比例的繼續(xù)提高，總黃酮含量開始下降，說明有效物質已經沉降完全。所以選擇濃縮比例1∶4作為工藝條件。

2.7 酸用量對朝鮮淫羊藿總黃酮物含量的影響

結果顯示，隨著溶液pH值增加，而淫羊藿總黃酮的含量也隨之增加，在pH=3穩(wěn)定，且含量最高(6.71%)，但隨著pH繼續(xù)增加總黃酮含量逐漸降低。原因是pH過高時會生成鋅鹽，以至析出的黃酮類化合物重新溶解，降低含量。所以選擇酸沉pH=3作為酸沉淀的工藝條件。

2.8 方法學考察結果

2.8.1精密度試驗結果

結果可知，平均值為0.415，RSD為1.6%。說明儀器精密度良好，適用于樣品總黃酮含量的測定。

2.8.2穩(wěn)定性試驗結果

結果可知，加入顯色劑顯色后，供試品在12 h內基本穩(wěn)定，測得值基本不變。平均數(shù)為6.63，RSD為1.12%。

2.8.3重復性試驗結果

結果可知,5次測得總黃酮含量分別為6.55%、6.67%、6.57%、6.69%、6.67%，平均含量是6.63%，RSD為1.00%，說明本法重復性良好。

2.8.4加樣回收率試驗結果

加樣回收率試驗結果顯示,5次測量結果的加樣回收率為100.5%，RSD為1.48%。

2.9 最優(yōu)條件提取樣品總黃酮

由最優(yōu)條件下提取的總黃酮含量為6.67%，與正交試驗最高值相當，符合《生藥學》[8]紫外-可見分光光度法測量標準：總黃酮含量>5.0%(總黃酮含量1.0%～8.0%)。表明該工藝合理可行，提取的總黃酮含量較高。

3 結 論

本研究選用堿提酸沉法提取朝鮮淫羊藿中總黃酮，利用紫外分光光度法測定其含量。通過單因素篩選主要影響因素，正交試驗對提取的最佳工藝條件進行優(yōu)化，各因素對提取工藝的影響順序為提取溶劑、提取次數(shù)、料液比、提取時間。確定的最佳提取工藝是：提取溶劑為0.3%NaOH溶液，回流提取2次，料液比為1∶40(g/mL)，時間為2 h，濃縮比例1∶4，鹽酸調節(jié)pH=3，朝鮮淫羊藿總黃酮提取量達6.67%，高于何凌等[9]乙醇提取淫羊藿總黃酮的實驗結果。該方法工藝簡單易行，準確度較好，穩(wěn)定性和重復性良好，為朝鮮淫羊藿總黃酮提取提供方法學依據(jù)。