張 冰，李 環(huán)

(北華大學醫(yī)學院,吉林 吉林 132013)

胃癌是最為常見的消化道惡性腫瘤，雖然胃癌的發(fā)病率在全球已呈現(xiàn)逐步降低的趨勢[1]，它仍是亞洲最常見的癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。胃癌的發(fā)生是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染、宿主和環(huán)境因素以及其他因素(如飲食和遺傳)共同作用的結(jié)果，其中細菌本身的致病能力在Hp致病過程中起重要的作用。早在1994年，Hp就被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌原[3]。在過去幾十年中，大量流行病學研究已明確Hp感染與胃癌之間的關(guān)系。然而Hp感染的病人中僅有一小部分人會發(fā)生比較嚴重的臨床結(jié)局，如胃潰瘍(10%)、萎縮性胃炎(5%)和胃的惡性腫瘤(2%)[4]。有研究表明這些不同的結(jié)局可能與Hp感染菌株的毒力因子有關(guān)[5]。幽門螺桿菌毒力因子(Helicobacter pylori adhesin A,HpaA)為Hp 所特有，存在于所有菌株中。是與宿主細胞特異性受體結(jié)合的亞單位,具有黏膜結(jié)合特性[6]。目前關(guān)于其與胃癌發(fā)病風險之間的研究鮮有報道，因此本研究用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測其抗體滴度，揭示Hp HpaA與胃癌發(fā)病風險之間的關(guān)系,為胃癌的病因研究提供新的線索。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究納入研究對象共179人，其中病例組86例來自于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院經(jīng)臨床新確診的胃癌病例；對照組來自于哈爾濱市香坊區(qū)疾病預(yù)防控制中心的健康體檢的人93例。

1.2 問卷調(diào)查

采用自行設(shè)計的問卷，經(jīng)嚴格、統(tǒng)一培訓的調(diào)查員對研究對象進行面對面詢問調(diào)查，并簽署知情同意書。調(diào)查問卷內(nèi)容包括一般人口學指標及主要相關(guān)的疾病暴露因素。完成后將調(diào)查表上的數(shù)據(jù)及時的錄入Epidate數(shù)據(jù)庫。采集研究對象靜脈血5 mL。

1.3 實驗室ELISA檢測

應(yīng)用間接ELISA方法檢測HpaA蛋白的抗體滴度，用HpaA蛋白稀釋濃度為0.25 mg/L包被96孔酶標板，4 ℃過夜；PBST洗滌液洗板3次后，加入200 μL 10%的山羊血清封閉液，37 ℃水浴2 h；棄封閉液，每孔中加入已稀釋3200倍的血清100 μL，而空白對照組每孔加入100 μL血清稀釋液，37 ℃水浴1 h；同上洗滌3次后，每孔加入100 μL已稀釋的(稀釋比例1∶5000)二抗辣根酶標記的羊抗人IgG， 37 ℃水浴30 min；同上洗滌3次后，每孔中加入TMB顯色液100 μL，37 ℃避光水浴15 min；加入等體積的1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，立即于450 nm處用酶標儀測定各孔的吸光度值(OD)。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，以雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計學意義，采用χ2檢驗來分析研究對象的基本情況；應(yīng)用非條件logistic回歸方法估計抗體血清陽性率與胃癌之間的OR值和95%可信區(qū)間(95% CI)；χ2趨勢檢驗用于評估抗體水平與胃癌之間的劑量反應(yīng)關(guān)系。約登指數(shù)最大值處的OD值作為篩查胃癌的最佳截斷值(cut-off)值，靈敏度、特異度及受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve， ROC曲線)下面積用來分析和評價目的蛋白作為Hp相關(guān)胃癌生物標志物在胃癌血清學篩查中的應(yīng)用價值。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的基本情況

病例組與對照組經(jīng)χ2檢驗，性別及受教育程度在病例組與對照組之間的分布均無統(tǒng)計學差異(P=0.328；P=0.656)。而在年齡、胃癌家族史、吸煙情況、飲酒情況、幽門螺桿菌感染情況，經(jīng)χ2檢驗兩組差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 血清HpaA抗體與胃癌之間的關(guān)系

2.3 ROC曲線結(jié)果

根據(jù)血清HpaA抗體滴度的情況，在全部受試者人群中，繪制ROC曲線，其曲線下面積分別為0.762，如圖1所示。HpaA抗體最佳cut-off值為0.3471，得到的靈敏度為81.40%，特異度為63.40%。

表 1 人群HpaA抗體血清陽性率與胃癌發(fā)病風險之間關(guān)系

表 2 全人群血清HpaA抗體水平與胃癌發(fā)病風險之間關(guān)系

表 3 Hp陽性血清HpaA抗體水平與胃癌發(fā)病風險之間關(guān)系

表 4 Hp陰性血清HpaA抗體水平與胃癌發(fā)病風險之間關(guān)系

圖 1 在全人群中HpaA抗體滴度測定的ROC曲線

3 討 論

胃癌的最終發(fā)生是一個多因素共同參與的過程， Hp感染的人中絕大部分都是無癥狀的病人。這就使惡性腫瘤的病人常常診斷在進展期，且這些病人5年的存活率<10%[7]。雖然，Hp感染是胃癌的高風險因子，Hp植入的個體中卻只有很少的一部分發(fā)展成了胃癌[2]，這表明，Hp菌株毒力的差異對于胃癌的病因?qū)W起到主要的作用[8-9]。許多研究者對Hp的毒力因子進行了研究，以期望能夠鑒定它們與胃癌臨床結(jié)果之間的相關(guān)性。目前大部分調(diào)查集中在以下幾種因素：細胞毒素相關(guān)基因蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)、血型抗原結(jié)合黏附素(BabA)、外炎性蛋白(OipA)以及十二指腸潰瘍產(chǎn)生基因(DupA)[10]。卻很少有流行病學的研究來鑒定Hp其他潛在的毒力因子。黏附素基因HpaA為Hp所特有，幾乎存在于所有臨床分離的菌株中。動物實驗已證明，HpaA是Hp定植的必要因子[6]。本研究通過病例對照研究了在人群中Hp HpaA血清抗體和胃癌發(fā)病風險之間的關(guān)系。

在本研究中，商業(yè)化的ELISA方法用來檢測Hp感染的狀態(tài)。然而，商業(yè)化的ELISA血清學不能檢測之前感染Hp的胃癌病人，例如，CagA抗體在那些血清學測試為陰性的病人中卻是陽性的。因為CagA抗體與抗Hp抗體相比在很長的時期內(nèi)仍然可保持陽性[11]。因此，陰性Hp血清學試驗不能排除之前感染暴露的可能性。為了排除這些對實驗結(jié)果可能存在的潛在影響，本研究同時也在Hp 陰性人群以及全人群中分析觀察了Hp HpaA與胃癌風險之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明應(yīng)該更多的關(guān)注抗體滴度和血清陽性率。同時，分析發(fā)現(xiàn)病例組HpaA抗體水平的中值高于對照組，Hp HpaA的高抗體效價可能是一個胃癌發(fā)展的危險因素。

研究發(fā)現(xiàn)，無論在全人群、Hp陽性人群以及Hp陰性人群中HpaA與胃癌的風險之間均存在顯著相關(guān)，HpaA抗體在Hp陽性人群的血清陽性率增加胃癌風險高達9.74倍。進一步的研究顯示，HpaA抗體水平與胃癌風險之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。為了驗證是否HpaA能夠作為篩查胃癌的生物標志物，我們繪制了ROC曲線。一般來說，AUC值在0.5～0.7間被認為準確度是低的，0.7～0.9有較好的準確性。高于0.9是高準確性的[12]。結(jié)果表明，在全部受試者中，HpaA曲線下面積是0.726，準確性較好，得到的靈敏度為81.40%，特異度為63.40%。提示HpaA可能作為一種新的血清生物標志物用于胃癌的篩查。

綜上所述，HpaA抗體血清陽性率與胃癌發(fā)病風險之間均存在顯著關(guān)聯(lián),且其抗體水平與胃癌風險之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。HpaA可能成為一個新的、理想的Hp相關(guān)的胃癌血清生物標志物。這一發(fā)現(xiàn)為早期胃癌的篩查提供了理論依據(jù)，并為胃癌的病因研究提供了新的線索 。