劉存霞 ，吳靜 ，田雪 ，趙巧雅 ，路曉 ，王林 ，李玉峰 ，宋敏訓(xùn) **

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250023；2.濟(jì)南億民動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250105）

鴨腸炎病毒（Duck Enteritis Virus，DEV）為雙鏈DNA病毒，最近一次國(guó)際病毒分類報(bào)告將DEV歸在皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科，馬立克病毒屬成員[1]。本實(shí)驗(yàn)室李玉峰[2，3]等率先通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法完成了DEV VAC疫苗株全基因組的序列測(cè)定與分析，從而為該病毒的分子生物學(xué)研究提供了理論數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)目前已完成基因組測(cè)序的禽皰疹病毒分析發(fā)現(xiàn)，在人或動(dòng)物皰疹病毒中未發(fā)現(xiàn)而在禽皰疹病毒中特有的5個(gè)基因，即 LORF11、LORF9、LORF3、LORF2 和 SORF3， 推測(cè)其在禽皰疹病毒感染能力或宿主范圍上扮演某種角色，Zelnik V等[4]將lac Z表達(dá)盒替換HVT的US1、US10、SORF3基因，重組病毒表達(dá) lac Z基因且病毒復(fù)制未受影響，推測(cè)SORF3為DEV復(fù)制非必需基因，也有報(bào)道SORF3蛋白具有跨膜區(qū)[5]。本研究對(duì)SORF3基因進(jìn)行原核表達(dá)，為SORF3基因功能的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和試劑 鴨病毒性腸炎病毒為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，CEF細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室制備。Ex-Taq DNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、PCR產(chǎn)物連接試劑盒pMD18-T載體、T4DNA連接酶、BSA、RNA酶及各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司和Promega公司；病毒基因組提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記兔抗His-Tag多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；IPTG為BBI公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為KPL公司產(chǎn)品；DAB購(gòu)自Biosharp生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中SORF3基因已有序列，通過(guò)primer primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物并加入EcoR I、Not I酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

擴(kuò)增片段為902bp，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.3 病毒基因組提取及PCR擴(kuò)增 取DEV按0.1MOI接種原代DEF細(xì)胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變，收集病毒液按試劑盒操作說(shuō)明提取病毒基因組，用引物SORF3-F、SORF3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配制 25μl PCR反應(yīng)體系：10×Ex Buffe 2.5μl、dNTPs(10mM)0.5μl、ExTaq 酶 0.25μl、 上 游引 物 （20pM）、下 游 引 物 （20pM）各 0.5μl，上 述cDNA 4μl，補(bǔ)水至 25μl，PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸40s；30 個(gè)循環(huán)，72℃再延伸 10min。

1.4 目的片段克隆測(cè)序 PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，用回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化與pMD18-T載體連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞。提取重組子質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD18-T-SORF3，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序分析。

1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建 將克隆質(zhì)粒pMD18-TSORF3、原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a經(jīng) EcoR I、Not I雙酶切，分別回收目的片段及載體片段，以T4DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21細(xì)胞，再次進(jìn)行經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET32a-SORF3。

1.6 原核表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化 挑取pET32a-SORF3 陽(yáng)性菌單克隆于 4ml LB/Kan（100μg/ml）培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)8～12h；按1：100體積比接種于50ml LB/Kan（100μg/ml）培養(yǎng)基中；37℃搖床培養(yǎng)至 OD600 為 0.55～0.65，加入 IPTG（500mmol/L）至終濃度為1.0mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)；pET-28a(+)空載體轉(zhuǎn)化菌株同步誘導(dǎo)作為對(duì)照，37℃ 5～6h培養(yǎng)，每隔1h取4ml培養(yǎng)液；離心收集誘導(dǎo)后的菌體，用冰預(yù)冷的裂解緩沖液重懸菌體，冰浴中超聲破碎菌體；離心分離可溶組分與包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá)并分析其表達(dá)形式。

表達(dá)條件的優(yōu)化：按上述操作在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.4～1.2mmol/L（5個(gè)濃度，梯度為 0.2mmol/L）分別進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔1h取樣1次，超聲破碎菌體；離心分離可溶組分與和包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物濃度。

1.7 重組蛋白的Western blot鑒定 將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上；用兔抗 His-Tag多克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR電泳結(jié)果 提取DEV基因組，以引物SORF3-F、SORF3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)900bp左右片段，與預(yù)期大小一致，見(jiàn)圖1，表明成功擴(kuò)增出目的片段。

圖1 PCR擴(kuò)增SORF3基因

2.2 克隆、表達(dá)載體構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化小提質(zhì)粒EcoR I、Not I雙酶切鑒定獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-SORF3，見(jiàn)圖2（左），同理構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-SORF3，以 EcoR I、Not I雙酶切鑒定，見(jiàn)圖 2（右），表明成功構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pMD18-T-SORF3和原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-SORF3。

圖2 質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.3 原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 BL21/pET32a-SORF3重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE分析表明IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37℃誘導(dǎo)4～5h目的蛋白可獲得較高水平的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，上清同樣有少量表達(dá)，重組蛋白電泳檢測(cè)SORF3蛋白為50kDa左右的蛋白，見(jiàn)圖3，結(jié)果成功表達(dá)SORF3蛋白。

圖3 pET32a-SORF3原核表達(dá)條件優(yōu)化SDS-PAGE電泳圖

2.4 Western Blot鑒定結(jié)果 以兔抗His-Tag多克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，上清沉淀中均可見(jiàn)目的條帶，見(jiàn)圖4所示。

圖4 SORF3基因表達(dá)Western Blot檢測(cè)

3 討論

到目前為止，已完成全基因組測(cè)序并發(fā)表的禽類皰疹病毒有 MDV、HVT、ILTV 和 PsHV[6，7]。 禽皰疹病毒基因分成兩大類：一是與其他α皰疹病毒同源的基因，這類基因在病毒基因組中占大多數(shù)；二是禽皰疹病毒特有基因，這類基因與病毒特有的生物學(xué)特性有關(guān)。程安春等[8]對(duì)鴨病毒性腸炎病毒基因組進(jìn)行了系統(tǒng)分析，但大多數(shù)基因的功能仍不清楚。 LORF11、LORF9、LORF3、LORF2 和SORF3分別位于DEV基因組長(zhǎng)片段的兩端和短片段的內(nèi)部。氨基酸同源性分析顯示與其他禽皰疹病毒相應(yīng)基因的同源性在24%～50%之間。其中LORF11、LORF9、LORF3、LORF2 存 在 于 MDV、HVT、DEV基因組內(nèi)，已知SORF3基因不僅存在于ILTV的基因組中，而且存在于其它禽皰疹病毒中。據(jù)推測(cè)僅存在于禽皰疹病毒基因組中5個(gè)基因可能與病毒獨(dú)特的致病機(jī)理有關(guān)。Zhong zhou等[9]以DEV為載體在其SORF3與US2基因之間插入鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）的E基因，免疫鴨后獲得抗病毒抗體。本研究針對(duì)SORF3基因構(gòu)建原核表達(dá)載體，SDS-PAGE及WB檢測(cè)結(jié)果表明，SORF3基因可在大腸桿菌培養(yǎng)上清及沉淀中檢測(cè)到蛋白表達(dá)，與母曉宇等[10]研究結(jié)果一致，該研究為下一步制備抗SORF3蛋白血清及功能的研究奠定基礎(chǔ)。