趙晶

[摘要] 目的 探討組蛋白去乙?；敢种苿〧K-228對Tca-8113細胞增殖、凋亡機制。 方法 低糖DMEM培養(yǎng)Tca-8113；倒置顯微鏡觀察Tca-8113細胞受FK228的作用；在不同藥物濃度處理24 h、48 h、72 h后利用CCK-8檢測Tca-8113細胞增殖情況；Tca-8113凋亡細胞利用DNA ladde試劑盒檢測。 結果 0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228對Tca-8113處理24 h、48 h、72 h后均有抑制作用，且與劑量、作用時間呈正相關。經(jīng)FK228藥物處理48 h后的細胞有DND LDEER出現(xiàn)。 結論 組蛋白去乙?；敢种苿〧K-228可呈降低人口腔鱗癌Tca-8113細胞活性，抑制其細胞增殖，誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] CCK-8；細胞凋亡；組蛋白去乙酰化酶抑制劑；FK-228

[中圖分類號] R739.8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）20-0044-03

Study on histone deacetylase inhibitor FK-228 in the induction of apoptosis of human tongue carcinoma cells

ZHAO Jing

Department of Stomatology， Fushun Mining Bureau General Hospital， Fushun 131000， China

[Objective] Abstract To investigate the mechanism of proliferation and apoptosis of Tca-8113 cells by histone deacetylase inhibitor FK-228. Methods Tca-8113 was cultured by low glucose DMEM； the effect of FK228 on Tca-8113 cells was observed by inverted microscope； the proliferation of Tca-8113 cells was detected by CCK-8 at 24h， 48h and 72h after being treated by different drug concentrations. Tca-8113 apoptotic cells were detected by DNA ladde kit. Results After Tca-8113 was treated for 24 h， 48 h and 72 by 0.1 μg/mL， 2 μg/mL and 4 μg/mL FK-228， all showed an inhibitory effect， which was positively correlated with the dose and the time of effect. There were DND LDEER appeared in cells treated with FK228 for 48 hours. Conclusion The histone deacetylase inhibitor FK-228 reduces the activity of human oral squamous carcinoma Tca-8113 cells， inhibits cell proliferation and induces apoptosis.

[Key words] CCK-8； Apoptosis； Histone deacetylase inhibitor； FK-228

口腔癌的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第六位，目前已是最常見的惡性腫瘤?？谇粣盒阅[瘤治療不理想[1]，口腔鱗癌是頭頸部常見惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的40%，而5年生存率僅40%～50%[2]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACis）抑制（包括組蛋白）殘留的賴氨酸蛋白的脫乙?；⒄{節(jié)各種基因的轉錄。近年來，已被臨床用作抗癌藥物和可能的抗糖尿病藥物，但有證據(jù)表明高劑量的HDACis是有細胞毒性的[3-4]。針對組蛋白去乙?；冈诎┌Y細胞中缺少調節(jié)這一弱點可作為治療腫瘤細胞的新靶點[5]。本實驗研究不同濃度的FK-228作用于口腔鱗癌Tca-8113后觀察細胞增殖、凋亡，討論組蛋白去乙?；敢种苿δ[瘤細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌癌鱗狀細胞Tca-8113由上海交通大學贈予。FK-228采購自美國MCE公司，DMEM、胎牛血清采購自Gibco公司，PBS液由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，CCK-8試劑盒由日本同仁采購，瓊脂糖凝膠由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，DNA Ladder凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞組織學培養(yǎng)及細胞觀察形態(tài) Tca-8113細胞復蘇后培養(yǎng)，待細胞貼壁生長旺盛時取3×105/孔接種于96孔板中，37℃ CO2溫箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后更換低糖DMEM培養(yǎng)液，實驗整體過程注意無菌操作，設立實驗組與空白對照組。24 h、48 h、72 h后在倒置相差顯微鏡下觀察藥物濃度為0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL后細胞形態(tài)變化。

1.2.2 細胞增殖檢測 通過CCK-8法檢測細胞抑制率：將對數(shù)生長的Tca-8113細胞3×105/孔置于96孔板中，24 h后更換培養(yǎng)液：①空白孔（培養(yǎng)液）；②對照組（不加藥）；③實驗組，加入終濃度為0.1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL FK-228。均設5個復孔。24 h、48 h、72 h后每孔滴入10 μL CCK-8液，避光放置。設定酶標儀讀數(shù)為450 nm，檢測96孔板內的吸光度值（A），重復實驗4次。收集數(shù)據(jù)計算細胞抑制率。

1.2.3 DNA Ladder試劑盒檢測凋亡 選擇生長旺盛Tac-8113細胞，使細胞濃度為3×105個/mL置于25 cm2細胞瓶中，待細胞貼壁后，設立對照組（不加藥）及實驗組，選擇實驗組藥物濃度為2.0 μg/mL。作用48 h后，離心收集2×106個細胞置于1.5 mL Eppendorf管中，PBS液輕輕清洗，將沉淀物中滴入Lysis Buffer 100 μL，實驗過程避光操作，10 s震蕩離心保留上清液，按說明書進行以下操作：滴入20 μL SolutionA、EnzymeA，輕輕搖勻在55℃恒溫1 h，加入EnzymeB 20 μL，37℃恒溫水域置1 h，滴入Precipitant 130 μL、冰乙醇950 μL，-20℃處理12 h后收集DNA，DNA用70%冷乙醇洗并干燥10 min，滴入TE Buffer 10 μL、Loading Buffer 2 μL，配置1.5%瓊脂糖凝膠，每孔加入20 μL試驗樣品，5 V/cm下電泳3 h，在紫外燈下觀察收集照片。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)學分析，本實驗數(shù)據(jù)為計數(shù)資料，細胞抑制率采用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FK-228對Tca-8113細胞形態(tài)的觀察

在倒置顯微鏡下，未經(jīng)藥物處理的舌癌Tca-8113細胞形態(tài)為多邊形，貼壁排列整齊規(guī)整，細胞有光澤。增加FK-228藥物濃度、延長FK-228藥物作用Tca-8113細胞時間，細胞外形開始變圓、體積縮小，透光度減低，藥物作用時間越長培養(yǎng)液中變形細胞漂浮越多，細胞顏色暗淡。而對照組中細胞貼壁生長良好，培養(yǎng)中漂浮細胞較少。

2.2 FK-228對Tca-8113細胞增殖的影響

與對照組比較，經(jīng)FK-228處理后的細胞數(shù)量及吸光度值隨著藥物濃度增加減少，與藥物劑量相關。隨著藥物作用時間延長，細胞存活率逐漸減低見封三圖7。通過χ2檢驗，24 h與48 h相比，χ2=4.06，P>0.05。24 h與48 h各濃度比較，χ2=11.314，P<0.05，48 h與72 h相比，χ2=2.196，P>0.05。48 h的抑制率分別為21.6%、38.72%、47.9%，72 h時培養(yǎng)液中有大量壞死細胞干擾抑制率所以不采取數(shù)據(jù)結果。

2.3 DNA Ladder檢測細胞凋亡

藥物濃度為2.0 μg/mL FK-228處理Tca-8113細胞48 h后細胞有凋亡發(fā)生。見封三圖8。

3 討論

組蛋白去乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）是一種氨基水解酶，組蛋白去乙酰化賴氨酸殘基，用于染色質重塑，因此在基因表達的表觀遺傳調控中起著至關重要的作用。由于其異常的活性和在多種癌癥中的過度表達，HDAC被認為是潛在的抗癌藥物靶點。HDACis對細胞毒性作用體現(xiàn)在正在增殖、己經(jīng)停止生長的惡性腫瘤細胞，而對誘導正常細胞死亡的劑量是惡性腫瘤細胞10倍或更多[5]。HDACis調節(jié)組蛋白和非組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，組蛋白和非組蛋白是細胞表觀遺傳修飾的關鍵分子，HDACis通過修復DNA、抑制細胞周期、誘導凋亡和改變基因表達來有效地抑制增殖。目前根據(jù)其化學結構不同可分為六類：（1）短脂肪酸類如丁酸鈉；（2）親電子酮類如三氟甲基酮；（3）異羥基肟酸如SAHA；（4）環(huán)四肽類如FK-228；（5）苯甲酰胺類如MGCD0103；（6）其他類[6]。到目前為止，有四種藥物，即SAHA、FK-228、PXD-101、LBH-589已經(jīng)獲得FDA的癌癥批準，部分HDACis目前正處于臨床試驗的不同階段[7-8]。SAHA和FK-228被批準用于第二線治療難治、持久或復發(fā)的皮膚T細胞淋巴瘤?；谑褂肏DACis的抗癌治療的潛在好處越來越多的證據(jù)導致了世界各地大量的專利申請[9]。

FK-228不含環(huán)氧酮基的環(huán)四肽類化合物的雙環(huán)，是從紫色素桿菌肉湯中分離得到。分子式為C24H36N4O6S2。在細胞介質、血漿中的FK-228能穿透細胞膜從而實現(xiàn)其穩(wěn)定物理性能。有最新研究表明，免疫性疾病、炎癥的治療、抑制血管生成、抗耐藥性及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病FK-228有明顯作用[10]。

FK-228對Tca-8113細胞的抑制增殖作用，隨著藥物濃度及時間的加長，Tca-8113細胞生長明顯受到抑制作用，細胞變形明顯、細胞凋亡、死亡增多。其機制可能與抑制HDAC1、HDAC2，加p19INK4d和p21Waf1/Cip1的表達，抑制CDK的表達有關。DNA ladder形成與HDAC1高度促進組蛋白乙酰化有關[11-12]。同時FK-228增加P21基因表達，減少S期細胞周期生成，細胞在G1期阻滯。組蛋白H3，H4乙?；黾樱ㄟ^非p53依賴型導致P21表達增加。誘導腫瘤細胞周期滯留在G1和G2/M[13]。

本實驗顯示，F(xiàn)K-228可以誘導Tca-8113細胞凋亡，凋亡原因可能是細胞凋亡的膜表面分子Fas/FasL基因啟動，活化凋亡啟使者caspase-3、caspase-8通路，下調Fas結合蛋白樣白介素1β轉換酶抑制蛋白表達，細胞骨架被重組，影響DNA結構、翻譯、修飾誘導細胞凋亡[14]。張旭輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)有絲分裂檢查點激酶Bub1蛋白、Bubr1蛋白著絲粒定位、紡錘體檢查點功能受到FK-228影響，有效抑制Survivin、AuroraB，腫瘤細胞的有絲分裂受到影響，腫瘤細胞受到殺傷。

綜上所述，F(xiàn)K-228體外誘導Tca-8113凋亡，為今后的治療口腔鱗癌的藥物研究打下實驗基礎。

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（收稿日期：2018-03-16）